Создание искусственных белков методами направленного мутагенеза

• Автор: Татьков, Сергей Иванович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 288 с. : ил.

Введение

Глава 1. Молекулярная эволюция белковых

молекул

1.1. Введение

1.2. Естественная эволюция белков

1.2.1. Эволюция гомологичных белков

1.3. Искусственная эволюция белков.

1.3.1. Пересортировка ДНК i или рекомбинация ДНК i vi.

1.3.2. Рекомбинация ДНК i viv

1.3.3. Методы диверсификации генов локализованным мутагенезом

1.3.4. Селекция белков i vi

1.4. Заключение
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Штаммы
2.2. Плазмиды и фаги.
2.3. Ферменты
2.4. Реактивы
2.5. Среды и Растворы
2.6. Модификация олигонуклеотида 4аминооксибутиламнном
2.7. Методика определения субстратных свойств модифицированных дезокснцигидин5 трифосфатов
2.8. Получение Сконцевого фрагмента гена афетонротсина.
2.9. Выделение гибридного белка I
2 Определение димерной структуры белков методом ковалентной сшивки.
2 Определение констант связывания гаммаинтерферона и его аналогов со специфическим клеточным рецептором, выполнено
Косаревым И.О., Институт инженерной иммунологии, Любучаны, Московской обл
2 Определение фагоцитозс тямулирующей и
антипролиферативной активности бачков
2 Определение фагоцитирующей активности моноцитов
2 Определение пролиферативной активности МНК.
2 Иммунизация кроликов и определение титров сывороток к хфетопро теину
2 Трансформация клеток . i плазмидной и фаговой ДНК
2 Культивирование штаммов и определение асфенотипа колоний
2 Приготовление фаговых штоков.
2 Аналитическое выделение плазмидной ДНК и репликативной
формы РФ фаговой ДНК.
Сепаративное выделение ДНК
2 Выделение фаговых частиц.
2 Выделение фаговой ДНК
2 Ферментативный гидролиз ДНК
2 Получение гибридного комплекса между одноцепочечной кольцевой ДНК фага М и линейной РФ того же фага
2 Модификация нитритом натрия одноцепочечной ДИК М и РФ ДНК М.
2 Модификация нитритом натрия гибридного комплекса
2 Репарация модифицированного одноцепочечного участка ДНК в двухцепочечиом гибридном комплексе гсчеродуплексе
2 Лигирование ДНК
2 Фосфорилированне олигонуклеотидов
2 Олигонуклеотиднаправленный мутагенез
Синтез РФ ДНК
Отбор мутантных клонов.
Определение нуклеотидной последовательности мутантных фагов.
2 Анализ первичной структуры ДНК.
2 Получение бактериофагов М тв1 и Мгт2.
2 Получение плазмиды рММ1. Плазмидный мутагенез
2 Идентификация маркерных делений рестрикционным анализом мутантных ДНК
2 Электрофоретический анализ белков
2 Культивирование штаммовпродуцентов уинтерферона и его аналогов.
2 Выделение мутантного белка А выполнялось Закабуниным А.И., НИКТИ БАВ.
2 Выделение мутантных белков и уингерферона выполнялось Майстрснко В.Ф. и Цивковской Н.О., НИКТИ БАВ
2 Ограниченный протеолиз трипсином уинтерферона и мутантных белков.
2 Протеолиз очищенных белков лизатом клеток Е. сой МН1.
2 Получение спектров кругового дихроизма.
2 Исследование экснонированности аромагических аминокислот методом тушения флуоресценции в присутствии йодистого калия выполнено Кишенко Т.П., НИКТИ БАВ
2 Определение антивирусной активности уинтерферона и мутантных белков выполнялось Нестеровым А., Кочневой Г.В., ВНИИ МБ.
2 Получение мутантных эукариотических факторов терминации трансляции еЯП выполнено Сиволобовой Г.Ф., Цивковским Р.Ю
2 Получение плазмиды рТП. обеспечивающей экспрессию полноразмерного гена эрф 1 и его мутантных вариантов получены Сиволобовой Г.Ф. и Цивковским Р.Ю.
2 Экспрессия и очистка сЮЧ дикого и мутантных типов выполнено Цивковским Р.Ю.
2 Определение активности мутантных еЯР т упго выполнено Фроловой Л.Ю. с сотрудниками
2 Статистическая обработка результатов.
2 Вероятность инактивации белка в результате единственной мутации х рассчитывали по уравнению I, как в работе 2 Глава 3. Совершенствование методов локализованного мутагенеза. Обсуждение результатов
3.1. Модификация нитритом натрия гетеродуплексов с одноцепочечной брешыо.
3.2. Разработка методов статистического мутагенеза с использованием 4аминооксибутиламина и его производных
3.2.1. Разработка способа введения мутаций в ограниченный район ДНК с использованием олигонуклеотида, модифицированного АОБА
3.2.2. Получение мутаций модификацией АОБА одноцепочечныч участков ДНК
3.2.3. Получение АОБАпроизводного 1СТР с1СТР и изучение его субстратных свойств в полимеразной системе ш гиго.
3.2.4. Исследование мутагенных свойств 6СТР.
3.3. Исследование мутагенных свойств модифицированных олигонуклеотидов
3.3.1. Роль репарационного пути в закреплении мутаций, индуцированных олигонуклеотидами
3.3.2. Мутационная тестсистема.
3.3.3. Исследование праймерных свойств модифицированных олигонуклеотидов
3.3.4. Мутагенные свойства рибоаналогов олигонуклеотидов
3.3.5. Пирофосфатпые производные
3.3.6. Фосфамидные производные олигонуклеотидов.
Рисунки к главе 3.
Глава 4. Определение функциональных районов белковой молекулы обсуждение результатов
4.1. Использование библиотек мутантных белков.
4.2. Поиск функционально важных остатков среди консервативных мотивов в неструктурированных областях белковой молекулы
4.2.1. Теоретическое обоснование предполагаемых мутаций в.
4.2.2. Получение мутантных белков
4.3. Заключение.
Рисунки к главе
Глава 5. Получение новых белков на примере уинтерферона человека обсуждение результатов.
5.1. Влияние интродукции отрицательного заряда в Сспираль на стабильность и активность уинтерфсрона.
5.2. Получение Сконцевых аналогов уинтерферона с повышенной устойчивостью к трипсиноподобным протеазам.
5.3. Усиление иммуногенности антигенов путем слияния с
дел ьтафероном
Рисунки к главе 5.
Благодарности.
Список цитированной литературы


В этом случае можно говорить о совпадении структурною и функциональною доменов. Выделяют пять типов доменов аспиральный, т. Многие ферменты, участвующие в метаболических путях, обладают структурой Ра8, которая напоминает бочку, внутренняя поверхность которой образована слоем из восьми р цепей, на которую уложены восемь аспиралсй рис. Структурными исследованиями было установлено, что последовательность ра8 состоит из двух доменов, один из которых находится на Кконце рис. Сконце рис. Каждый из доменов не обладает какойлибо каталитической активностью, но при их объединении в р появляется ферментативная активность . Рис. Примерра8 структуры фермент имидазолглицерофосфатсинтаза i, который катализирует одну из стадий биоснтеза гистидина. Номерами обозначены V цепи, начиная с конца белковой молекулы. Стрелками обозначены структурные участки. Темнозеленым цветом обозначена концевая половила структуры, светлозеленым е Скониевая часть. Рисунок взят из работы . Была высказана гипотеза, что предок ра образовался в результате дупликации Ра, а затем вследствие спонтанного мутагенеза возник пул таких белков, домеиы которых различались по первичной структуре. Из полученною пула в результате рекомбинации между Ра4доменами возникли многочисленные ферменты . Экспериментальным подтверждением данной гипотезы об образовании из предшественника Ра путем его дупликации и объединения , , явилось получение i vi перекрестных рекомбинантных ферментов i, i. Полученные гибридные белки проявили соответствующие ферментативные активности. Роль объединения доменов в создании новых белковых функционально активных молекул иллюстрирует схема рис. ЕПЗС лаг. I л. Рис. Схема эволюции ферментов на основе звена Ра Взята из статьи . Как уже упоминалось выше. Ра структуры с другими доменами . Сеть сигнальных клеточных белков также возникла в результате междоменного слияния. Как правило, у сигнальных белков физически и функционально обособлен домен, ответственный за каталитическую активность. Домены или мотивы, ответственные за связывание с входным или выходным сигналами, меняются в соответствии с блочным принципом. Тем самым обеспечивается большое разнообразие сигнальных белков . По аналогии с естественной эволюцией белков разработана методология их эволюции i i рис. Для успешной селекции необходимо, чтобы между генами и белками продуктами их экспрессии, существовала физическая или химическая связь. В этом случае после отбора по свойствам нужных мутантных вариантов белковой молекулы, мы одновременно проведем и селекцию соответствующих этим вариантам генов. Отобранные гены можно амплнфнцнровать. Так можно получить гены, кодирующие белки со свойствами, измененными в интересуюнем исследователя направлении. I
ь
I
Рис. Схема искусственной эволюции белков. Пул мутантных генов обрабатывают ДНКазой I, выделяют фрагменты 0 п. Стадию выделения фрагментов можно исключить, если ввести в ДНК в ходе ПЦР урацил, затем е обработать урацилДНКгликозилазой и разрушить на фрагменты с помощью пиперидина . В результате получают новую библиотеку мутантных генов, которые возникают в ходе многочисленных перетасовок фрагментов исходных ДНК рис. Разработанная схема напоминает естественную эволюцию генов. Если в руках исследователя оказывается еще и эффективный механизм селекции генов, измененных в необходимом для него направлении, то можно применять несколько раундов перетасовки и получать в результате мутантные гены, которые кодируют белки с улучшенными свойствами. Таким способом, например, удается повысить активность ферментов в сотни тысячи раз всего за раундов пересортировки 4, или изменить их специфичность . Часто мутации, которые приводят к столь значительному повышению активности, не входят в активный центр фермента, но стабилизируют его олигомерную структуру. В случае ДНКметилаз несколько точечных мутаций, которые не входят в состав консервативных мотивов или поверхностных вариабельных участков, предположительно ответственных за узнавание специфических ДНКпоследоватсльностен, смогли изменить узнаваему ю последовательность . Рис.