Разработка и изучение генно-инженерных вакцин для терапии опухолей

• Автор: Ларин, Сергей Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН.

1.1. Механизмы противоопухолевого иммунного ответа.

1.1.1. Защитные функции системы адаптивного иммунитета

1.1.1.1. Механизмы ускользания трансформированных клеток от иммунного надзора

1.1.1.2. Современные представления о теории сигналов опасности i.

1.1.1.3. Опухолевые антигены распознаваемые иммунной системой. .

1.1.2. Распознавание опухолевых клеток системой врожденного иммунитета

1.1.2.1. Распознающие рецепторы на поверхности нормальных киллерных клеток.

1.1.2.2. 2 активационный рецептор распознающий опухолевые клетки.

1.1.2.3. Естественные цитотоксические рецепторы

1.1.2.4. Активационные рецепторы I и I семейств рецепторов нормальных киллеров
1.1.2.5. Активирующие Слсктиновые рецепторы нормальных киллеров.
1.1.2.6. клетки как противоопухолевые эффекторы
1.2. Характеристика семейства генов млекопитающих 7 .
1.2.1. Молекулярно генетическая характеристика генов 7 и
1.2.2. Функциональная характеристика семейства
1.3. Основные стратегии современной противоопухолевой вакцинации
1.3.1. Использование генетически модифицированных опухолевых клеток в качестве вакцины
1.3.2. Антиген специфические противораковые вакцины.
1.3.2.1. Пептидные вакцины.
1.3.2.2. Рекомбинантные вирусные вакцины.
1.3.2.3. Рекомбинантные бактериальные вакцины
1.3.2.4. ДНК и РНК вакцины.
1.3.3. Дендритные клетки как компонент противораковой вакцины.
1.3.4. Белки теплового шока в качестве носителей антигенов
1.3.5. Потенциальные возможности увеличения эффективности вакцинации
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Ферменты и реактивы
2.2. Плазмидные векторы и клонирование
2.3. Агарозный гельэлектофорез ДНК.
2.4. Трансформация клеток . i.
2.5. Выделение плазмидной ДНК.
2.6. Культивирование клеточных линий
2.7. Получение стабильно трансфецированных клонов С и В
2.8. Транзиториая трансфекция культуры опухолевых клеток
2.9. Облучение клеток.
2 Анализ скорости роста опухолей i viv
2 Иммунопреципитация белка 7 из кондиционной среды.
2 Электрофорез в ДСНПААГ и иммуноблот анализ.
2 Выявление экспрессии репортерного гена гадоктозидазы.
2 Иммуногистохимический анализ опухолевого материала
2 Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Противоопухолевый эффект экспрессии гена проявляется в рамках различных моделей злокачественных новообразований.
3.2. Транзиторнотрансформированные опухолевые клетки эффективны для профилактики образования экспериментальных опухолей.
3.3. Противоопухолевый эффект генетически модифицированных опухолевых клеток определяется секрецией белка
3.4. Исследование опухолей после вакцинации генетически модифицированными клетками доказывает участие клеток иммунной системы в торможении опухолевого роста
3.5. Для успешной вакцинации генетически модифицированными опухолевыми клетками необходимо участие Т лимфоцитов
3.6. Применение генетически модифицированных клеток эффективно для терапии сформированного опухолевого узла
3.7. Результативность использования генетически модифицированных клеток для терапии множественных метастазов.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
5. ВЫВОДЫ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
Список сокращений.
АПК антиген презеитирующие клетки
ДСНПЛАГ додецилсульфат натрия полиакриламидный гель
ИТАМ иммунорецепторный, базирующийся на тирозине
активационный мотив ИТИМ иммунорецепторный, базирующийся на тирозине
ингибиторный мотив ГАЕ трисасстатный электрофорезный буффер
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
рецептор константной части иммуноглобулина
i Т цитолитический Т
лимфоцит
ii дендритные клетки
x ii
гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор
Ix. i человеческие
лейкоцитарные антигены
I i интерферон
I ii интерлейкин
I



i iii иммуноглобулино подобный рецептор киллерных клеток
iii иммуноглобулино подобный рецептор лейкоцитов
iiii x главный комплекс гистосовместимости
i нормальные киллерные клетки
ii i простатический специфический антиген
трис солевой буфер, содержащий 0,
Т Т клеточный рецептор
i подобный рецептор
i фактор некроза опухолей
Введение


Оглавление. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН. Механизмы противоопухолевого иммунного ответа. Современные представления о теории сигналов опасности i. Опухолевые антигены распознаваемые иммунной системой. Распознающие рецепторы на поверхности нормальных киллерных клеток. Активирующие Слсктиновые рецепторы нормальных киллеров. Характеристика семейства генов млекопитающих 7 . Антиген специфические противораковые вакцины. Пептидные вакцины. Рекомбинантные вирусные вакцины. ДНК и РНК вакцины. Дендритные клетки как компонент противораковой вакцины. Агарозный гельэлектофорез ДНК. Трансформация клеток . Выделение плазмидной ДНК. Облучение клеток. Иммунопреципитация белка 7 из кондиционной среды. Электрофорез в ДСНПААГ и иммуноблот анализ. Выявление экспрессии репортерного гена гадоктозидазы. Противоопухолевый эффект экспрессии гена проявляется в рамках различных моделей злокачественных новообразований. Транзиторнотрансформированные опухолевые клетки эффективны для профилактики образования экспериментальных опухолей. Результативность использования генетически модифицированных клеток для терапии множественных метастазов. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ВЫВОДЫ. Список сокращений. Ix. Введение. Эдвард Дженнер v привил восьмилетнему Джеймсу Фиппсу i вирус коровьей оспы, полученный из инфицированной руки доярки Сары Нельмес . Своим экспериментом Дженнер продемонстрировал резистентность мальчика по отношению к оспе. Новая процедура стала известной как вакцинация. Несмотря на некий скептицизм, вакцинация была широко принята, x вирус был позднее вытеснен vii вирусом, который вызывал более мягкую реакцию на вакцинацию при сохранении стойкого перекрестного иммунитета. Таким образом, Дженнером были заложены основы науки вакцинации и иммунологии , а принцип использования родственного, менее опасного или ослабленного иммуногена для индукции иммунного ответа на кроссреактивиые высоко вирулентные патогены был широко использован Луи Пастером i , продемонстрировавшим защиту от холеры 8 и сибирской язвы 7. С конца XIX начала XX века ученые изучают взаимодействие между иммунной системой и раковыми клетками, с целью усиления противоопухолевого иммунитета для терапии рака. В конце XIX века Вильям Коли ii начал лечить раковых пациентов бактериальными экстрактами xi для активации общего системного иммунитета, часть которого может быть направлена против опухоли 3. В отличии от профилактических вакцин против инфекционных агентов, для которых индукция нейтрализующего гуморального иммунитета является наиболее значимым звеном, основное направление противораковой вакцинации сфокусировано на развитии антиген специфического Тлимфоцитарного ответа 5. По литературным данным одним из эффективных способов генерации специфического противоопухолевого иммунитета является создание вакцин на основе генетически модифицированных опухолевых клеток. Основой этого направления следует считать работу i и i , в которой было показано, что вакцинация с использованием лизатов опухолевых клеток, инфицированных вирусом гриппа, вызывает системный иммунный ответ при последующем введении неинфицированных опухолевых клеток. В настоящее время для модификации опухолевых клеток, с целью дальнейшего терапевтического применения, широко используют гены различных цитокинов, таких как I2, I4, I, I , стимуляторы ых молекул и последовательности, кодирующие высокоиммуногенные пептиды 5. В нашей лаборатории ранее был клонирован 4 и охарактеризован новый ген млекопитающих 7 , проявляющий свойства цигокина и обладающий противоопухолевой активностью 2, , , . Полученные экспериментальные данные позволяли предположить, что возможно применение гена в противоопухолевой терапии.