Получение, характеристика и возможности дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека

• Автор: Прыжкова, Марина Вячеславовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 109 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Понятие стволовой клетки

1.2. Региональные стволовые клетки человека и их дифферениировочиый потенциал

1.2.1. Стволовые клетки костного мозга

1.2.2. Стволовые клетки внутренних органов

1.2.3. Стволовые клетки кожи, глаз, зубной ткани, молочной железы и головного мозга

1.3. Фетальные стволовые клетки.

1.3.1. Фетальные ИСК

1.3.2. Клетки эмбриональной карциномы.

1.3.3. Примордиальные зародышевые стволовые клетки

1.4. Эмбриональные стволовые клетки .

1.4.1. Эмбриональные стволовые клетки мыши
1.4.2. Получение и характеристика ЭСК человека
1.4.2.1. Получение линий ЭСК человека.
1.4.2.2. Характеристика линий ЭСК человека
1.4.3. Использование различных фидеров для культивирования ЭСК человека.
1.4.4. Ьесфидернос культивирование ЭСК человека.
1.4.5. Дифферснцировка ЭСК человека.
1.4.5.1. Нейральная днффереицировка.
1.4.5.2. Днффереицировка ЭСК человека в кардиомноцнты.
1.4.5.3. Дифференцировка в клеткипредшсственники сосудов и гемопоэтичсскис клетки
1.4.5.4. Дифференцировка в инсулинпродуцирующне клетки и гепатоциты
1.4.5.5. Дифференцировка в меланоциты и остеобласты.
1.4.5.6. Дифференцировка в клетки трофэктодсрмы.
1.4.6. Генетическое модифицирование.
1.4.7. Механизмы поддержания плюрипотентного состояния ЭСК
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы
2.1.1. Ферменты и реактивы
2.1.2. Антитела.
2.1.3. Праймера.
2.1.4. Эмбрионы человека
2.1.5. Линии мышей
2.1.6. Линии ЭСК мыши.
2.2. Методы.
2.2.1. Приготовление фидерного слоя мышиных эмбриональных фибробластов
2.2.1.1. Состав среды для культивирования МЭФ.
2.2.1.2. Получение мышиных эмбриональных фибробластов.
2.2.1.3. Заморозка и оттаивание мышиных эмбриональных фибробластов
2.2.1.4. Желатинизированис культуральных чашек и планшетов
2.2.1.5. Обработка МЭФ ми гомицином С.
2.2.1.6. Облучение мышиных эмбриональных фибробластов.
2.2.2. Культивирование ЭСК мыши.
2.2.3. Получение химерных мышей.
2.2.4. Получение ЭСК мыши.
2.2.5. Получение ЭСК человека.
2.2.5.1. Состав среды для культивирования ЭСК человека.
2.2.5.2. Обработка бластоцист проназой.
2.2.5.3. Иммунохирургия
2.2.5.4. Культивирование внутренней клеточной массы бластоцисты
2.2.5.5. Приготовление раствора коллагеназы IV.
2.2.5.6. Культивирование клеточных линий.
2.2.6. Иммуноцитохимия.
2.2.6.1. Методика окраски антителами клеточных культур.
2.2.6.2. Методика окраски антителами срезов эмбриоидиых телец
2.2.7. Кариотипирование
2.2.8. Получение эмбриоидиых телец.
2.2.9. Диффсренцировка ЭСК по нейральному пути.
2.2 Подготовка образцов клеток и выделение РНК.
2.2 Полуколичественный ОГПЦР анализ
2.2 Фракционирование фрагментов ДНК
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Освоение методик работы с ЭСК мыши
3.2. Получение ЭСК мыши и человека.
3.3. Получение ЭСК человека с использованием метода иммуиохнрургни.
3.4. Заморозка ЭСК человека
3.5. Морфологическая характеристика
3.6. Кариотипирование
3.7. Характеристика по специфическим маркрам
3.8. Дифференцировка ЭСК человека в эмбриоидиых тельцах
3.9. Нейральная диффсренцировка
3 Экспрессия генов , ОСТ4, 5, 5 и 3 в недифференцированных ЭСК человека и на ранних этапах их дифференцировки
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
5. ВЫВОДЫ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
МЭФ мышиные эмбриональные фибробласты ВКМ внутренняя клеточная масса ЭСК эмбриональные стволовые клетки КМ костный мозг
ГСК гемопоэтические стволовые клетки РГК региональные стволовые клетки ПЗК примордиальные зародышевые клетки МСК мезенхимные стволовые клетки НСК нейральные стволовые клетки ЦНС центральная нервная система
ОТПЦР обратной транскрипции полимеразная цепная реакция
ПЦР полимеразная цепная реакция
п.о. пары оснований
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
РНК рибонуклеиновая кислота
ii i i
i i
I i iii
i i
i
ВВЕДЕНИЕ


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. Фетальные стволовые клетки. Клетки эмбриональной карциномы. Эмбриональные стволовые клетки . Получение линий ЭСК человека. Использование различных фидеров для культивирования ЭСК человека. Ьесфидернос культивирование ЭСК человека. Дифферснцировка ЭСК человека. Нейральная днффереицировка. Днффереицировка ЭСК человека в кардиомноцнты. Дифференцировка в меланоциты и остеобласты. Дифференцировка в клетки трофэктодсрмы. Генетическое модифицирование. Антитела. Праймера. Линии ЭСК мыши. Методы. Состав среды для культивирования МЭФ. Получение мышиных эмбриональных фибробластов. Обработка МЭФ ми гомицином С. Облучение мышиных эмбриональных фибробластов. Культивирование ЭСК мыши. Получение химерных мышей. Получение ЭСК мыши. Получение ЭСК человека. Состав среды для культивирования ЭСК человека. Обработка бластоцист проназой. Приготовление раствора коллагеназы IV. Культивирование клеточных линий. Иммуноцитохимия. Методика окраски антителами клеточных культур. Получение эмбриоидиых телец. Диффсренцировка ЭСК по нейральному пути. Подготовка образцов клеток и выделение РНК. Получение ЭСК мыши и человека. Получение ЭСК человека с использованием метода иммуиохнрургни. ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ВЫВОДЫ. Возможность использования клеточных ресурсов человеческого организма для лечения ряда заболевании всегда интересовала учных и медиков. В х годах изучение стволовых клеток взрослого человека началось с гемопоэтических и нейральных стволовых клеток i, и др. Чертков И. I. и Фридспштсйн Л. Я., . В последствии стволовые клетки были обнаружены во многих iанах и тканях, разработаны условия для их культивирования, но споры и дебаты о потенциальных возможностях их применения продолжаются до настоящего времени. Стволовые клетки взрослого организма не могут проходить большое количество пассажей и быстро дифференцируются, что ограничивает как возможности проведения научных исследований, так и их практическое применение. Поэтому получение в году линий ЭСК мыши открыло новые перспективы i, , v, , , М. Считается, что ЭСК способны к неограниченному числу клеточных делений, способны к самолоддержанню своей популяции и, вместе с тем, могут дифференцироваться в любой тип клеток. Сочетание пролиферативного потенциала эмбриональных стволовых клеток со способностью к дифферсицировке делает их уникальными. Вместе с ЭСК появилась возможность изучения процессов дифференцировки клеток на ранних этапах развития эмбрионов, внесения генетических изменений в развивающийся организм, создания модельных животных для разработки методов лечения различных заболеваний. Впервые эмбриональные стволовые клетки человека были получены , и др. Дифференцированные производные ЭСК человека могут быть использованы для восстановления функциональности тканей при широком спектре заболеваний, связанных с утратой клетками возможности нормально функционировать. Сюда относятся нейродегенеративиые заболевания, повреждения ЦНС, заболевания сердца, диабет и другие. Болес млн. США нуждаются в донорских органах. Трансплантация производных ЭСК человека могла бы существенно помочь в решении данных проблем. Линии ЭСК человека получены в ряде научноисследовательских организаций Европы, США, Азии и стран Востока. Однако, весьма небольшой опыт работы с ними во всем мире всего лет, их ограниченная доступность коммерчески можно приобрести всего 6 линий, их индивидуальная уникальность заставляет исследователей получать новые линии ЭСК человека. Освоить методики работы с ЭСК мыши. Получить и дать характеристику линиям ЭСК человека. Оптимизировать существующую методику получения ЭСК человека. Изучить экспрессию генов, связанных с поддержанием плюрипотентности, в ЭСК человека по мере их диффереицировки.