Терминация трансляции у эукариот с вариантными генетическими кодами: узнавание стоп-кодонов фактором терминации трансляции eRF1

• Автор: Лекомцев, Сергей Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Терминация трансляции

1.1.1. Факторы терминации 1 го класса

1.1.2. Факторы терминации 2го класса

1.2. Вариантные генетические коды

1.2.1. Митохондрии

1.2.2. Прокариоты

1.2.3. Эукариоты

1.2.4. Кодирование селеноцистеина и пирролизина
1.3. Гипотезы о причинах возникновения вариантных
генетических кодов
1.3.1. Гипотеза исчезновения кодона
1.3.2. Гипотеза минимизации генома
1.3.3. Г ипотеза неопределенного интермедиата
1.3.4. Г ипотеза точечного мутагенеза еИР 1
1.4. Эволюция генетического кода
Глава 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы бактерий и плазмиды
2.1.2. Среды
2.1.3. Реактивы
2.1.4. Ферменты
2.1.5. Олигонуклеотиды
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение плазмидной ДНК из Е.соИ
2.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.3. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и
реакция лигирования ДНК
2.2.4. Трансформация Е. i плазмидной ДНК
2.2.5. Полимеразная цепная реакция ПЦР
2.2.6. Сайтнаправленный мутагенез методом мегапраймера
2.2.7. Метод мегапраймерной ПЦР со сменой матрицы
2.2.8. Амплификация концевых частей гена
i и i i
2.2.9. Конструирование генов химерных
2.2 Синтез и выделение белков
2.2 Электрофорез белков в денатурирующем ПААГ
2.2 Определение активности
2.2 Культура клеток и трансфекция
2.2 Измерение активности люциферазы и ргалактозидазы
2.2 Определение уровня сквозного прочтения
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Измерение i vi активности химерных стилонихиячеловек
3.2. Определение влияния химерных стилонихиячеловек
на уровень сквозного прочтения в клетках человека
3.3. Измерение i vi активности мутантных парамециячеловек
3.4. Определение влияния химерных эуплотачеловек
на уровень сквозного прочтения в клетках человека
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Методы определения специфичности декодирования
4.2. Специфичность узнавания стопкодонов в ресничных
определяется концевым доменом 1
4.3. В ресничных i и i специфичность достигается за счет различных аминокислотных остатков концевого домена 1
4.4. Два участка последовательности эуплоты,
препятствующие декодированию кодона
4.5. Аминокислотные остатки , определяющие специфичность узнавания стопкодонов различны в ресничных i,
i и
4.6. Возникновение вариантного генетического кода в ресничных
гипотеза мутагенеза 1
4.7. Заключение
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Более того, стопкодоны и могут кодировать селеноцистеин я аминокислота и пирролизин я аминокислота соответственно в организмах как с универсальным, так и с вариантным генетическим кодом Нао . В универсальном коде стопкодоны , и используются для терминации трансляции и узнаются факторами терминации 1го класса, которые затем индуцируют гидролиз пептидилтРНК в рибосоме. и соответственно, а в эукариотах фактор узнает все три стопкодона iv . Функционально сходны с тРНК, т. iv i, . За узнавание стопкодонов ответствен концевой домен . v . v . ii . v . Факторы терминации 2го класса, 3 и 3, представляют собой зависимые для 3 и рибосомозависимые азы, которые стимулируют активность факторов 1го класса v . viv . v . 12 из рибосом. Во многих вариантах альтернативного кода происходит изменение смысла стопкодонов. Переосмысленные стопкодоны больше не используются для терминации трансляции, а кодируют аминокислотный остаток. Для этого необходимо присутствие тРНК, которая может узнавать стопкодон, что возможно, если антикодон тРНК мутирует. В свою очередь, фактор терминации 1го класса должен потерять способность узнавать такой переосмысленный стопкодон или иметь к нему низкое сродство, позволяя соответствующей тРНК декодировать этот стопкодон. Общепринято, что ресничные произошли от организмов с универсальным кодом, поэтому в первичной структуре ресничных должны существовать аминокислотные остатки, ответственные за изменение специфичности декодирования стопкодонов. Одной из наиболее широко представленных групп организмов с вариантным генетическим кодом у эукариот являются ресничные инфузории. В этой группе организмов встречаются различные виды вариантных кодов. Например, в ресничных кодон кодирует цистеин . i триптофан . В ресничных i и i кодоны и используются для кодирования глутамина и только служит для терминации биосинтеза белка , i, . Молекулярные механизмы декодирования стопкодонов у организмов с универсальным генетическим кодом изучены недостаточно, а у организмов с вариантным генетическим кодом вообще не изучены. В организмах с вариантным генетическим кодоном об узнавании стопкодонов известно очень мало. Почти ничего неизвестно об аминокислотных остатках фактора ресничных, ответственных за специфичность узнавания стопкодонов. Неизвестны также пути возникновения вариантных кодов у ресничных что возникло раньше переосмысление стопкодона ов в значащий значащие или изменение специфичности декодирования Изучение декодирующих свойств ресничных инфузорий является не только актуальным, но и позволит приблизиться к пониманию возможных путей возникновения вариантных генетических кодов у ресничных. Основная цель работы состояла в идентификации участков концевого домена ресничных, относящихся к разным вариантным кодам, которые определяют декодирующие свойства этих белков. В рамках поставленной цели сформулированы следующие задачи 1 экспериментально показать, что концевые домены ресничных, подобно концевым доменам со стандартным кодом, целиком определяют декодирующие свойства исследуемых факторов 2 получить химерные конструкции, сочетающие различные участки домена ресничных и человека 3 выделить, очистить и охарактеризовать функциональную активность полученных химерных форм 4 получить генноинженерные конструкции химерных для экспрессии i viv в клетках человека 5 охарактеризовать влияние химерных на уровень сквозного прочтения в отношении 3х стопкодонов в клетках человека. В этой работе исследовали декодирующие свойства трех ресничных инфузорий i, i i и i i. эволюционном древе ресничные и млекопитающие находятся далеко друг от друга, поэтому существует большая вероятность неэффективного связывания ресничных с рибосомой млекопитающих.