Структурно-функциональное исследование сайт-специфического метилирования ДНК эукариот

• Автор: Шевчук, Тарас Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 232 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Распределение 5метилцитозина в различных нуклеотидных последовательностях и областях генома высших эукариот

1.1. Метилируемые последовательности эукариотических ДНК

1.2. СрОостровки и их свойства.

2. Структурнофункциональные свойства цитозннС5ДНКметилтрансфераз

2.1. Функциональная топография первичной структуры прокариотических цнтозинС5ДНКметнлтрансфераз

2.2. Эукариотические ДНКметилазы.

2.2.1. ДНКметнлтрансферазы млекопитающих

2.2.2. ДНКметилгрансферазы растений.

3. Тотальное метилирование цитозина в эукариотических ДНК

и РНКинтсрфсренция
4. Процесс тотального метилирования последовательностей
ДНК грибов.
5. Регуляция экспрессии и модуляции активности ДНКметилтрансфераз
6. Функциональная роль специфических типов метилирования
ДНК эукариот.
6.1. Первичная функция метилирования ДНК защита от
внучригеномных паразитов.
6.2. СрСтип метилирования ДНК
6.2.1. Метилирование и транскрипция генов. Белки, связывающиеся с метилированной ДИК
6.2.2. Метилирование ДНК, структура хроматина 1 деацетилнрование пилонов
6.2.3. Деметилирование ДНК
6.2.4. Метилирование ДНК и геномный имиринтинг
6.2.5. Роль метилирования ДНК в развитии растений.
6.2.6. Метилирование ДНК и канцерогенез.
6.2.6.1. Гипометилированне ДНК
6.2.6.2. Увеличение ДНКметилтрансферазной активности в опухолевых клетах.
6.2.6.3. Локальное гиперметилирование генома
6.3. Несимметричный тип метилирования ДНК
6.3.1. Мет илирование ДНК и ее репликация.
6.3.2. Метилирование ДНК и выключение
генетической экспрессии
Заключение
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Материалы и оборудование.
1.1. Оборудование
1.2. Реактивы, среды и ферменты
1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды.
1.4. Растительный материал.
1.5. Культура клеток млекопитающих.
2. Методы.
1. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Разработка метода определения уровня метилирования последовательностей ССТЮ в ДНК
2. Трансгеннндуцированное СОУСОмстилированнс ДНК
растений ШсоНапа аЬасгоп
2.1. Интеграция гена ДНКметнлтрапсферазы сЛП в
ТДНК агробактериальной Тьплазмиды дикого типа.
2.2. Интеграция модифицированного гена ДНКмстилтрансферазы 0.II в обезоруженный агробактсриальный вектор.
2.3. Получение трансгенных опухолевых линии 4i шЬасит, содержащих ген ДНКметилтрансферазы соДИИЗ
2.3.1. Физиологобиохимическая характеристика трансгенных опухолевых линий МсоНана аЬасит
2.3.2. Уровень метилирования последовательностей СССО в геноме трансгенных опухолевых линий Меоапа аЬасит
2.4. Получение трансгенных растении 4i аЬасит, содержащих модифицированный ген МЬ8Мсо1Ш.
2.4.1. Получение трансформированных растении
Шсошпа шЬасит.
2.4.2. Физиологобиохимическая характеристика
трансгенных растений Шсоапа аЬасит
2.4.3. Определение уровня метилирования цитозина в последовательностях ССУСО ДНК трансформированных растений Лсоапа аЬасит
3. Метилирование ДНК растений сгуьапит
3.1. Определение уровня метилирования последовательностей ССХУвО в ДНК МезетЬгуапЬетит сгузапит
3.2. Поиск мишеней для ССЛУССгиперметнлировання в геноме МезетЬгуашЬетшп сгуяШпит
4. Анализ метилирования гена кальцитонина человека при лейкозах
4.1. Анализ последовательностей ССХЗО
4.1.1. Гнперметилирование гена кальцитонина при
мнелондных лейкозах
4.1.2. Гнперметилирование гена кальцитонина при
остром лимфоидном лейкозе
4.2. Анализ последовательное гей ССЗУСб
5. Трансгеннндуцнрованное ССЛУОС метилирование ДНК клеток эпителиального слоя почек человека НК
5.1. Получение трансгенных клеток НК3, экспрессирующих модифицированный ген
5.2. Анализ метилирования генома трансформированных клеток, экспрессирующих ген химерного белка II
5.2.1. v метилирование сайтов .
5.2.2. Анализ метилирования последовательностей
5.2.3. Состояние метилирования промоторов генов
I В5 и АРС
5.2.4. Анализ экспрессии метилированного гена АРС
5.2.5. Эффект метилирования на активность ДНКмститрансферазы 1.
6. Применение ДНКметилтрансфераз в нанобиотехнологии
6.1. Создание ингибиторов ДНКметилгрансфераз
третьего поколения
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
СОКРАЩЕНИЯ
6БАП 6бензиламинопурнн НУК нафтилуксусная кислота п.п. пара нуклеотидов т.п.н. тысяча пар нуклеотидов
промотор РНК вируса мозаики цветной капусты 5 5азацитидин азидодезоксипимидин
САМ i i метаболизм органических кислот по типу толегянковых
СаМ V вирус мозаики цветной капусты
v консервативные районы цнтозинС5ДНКметил трансфера
СМТЗ раепгтельная хромометилаза V цитомегаловнрус
штамм Е.соН, мутантный по цитозиновой ДНКметнлтрансферазе
штамм Е.соН, мутантный по цитозиновой ДНКметилтрансферазе
цитозинС5ДНКмстилтрансфераза мыши
1 цитозннС5ДНКмстилтрансфераза человека
i растительная цитозинС5ДНК
мегилтрансфераза
НА Г гнетоновая ацетилтрансфераза I I С гистоновая деацетилаза
i фракция мелких Нра 1фрагментов II бактериальная цитозинС5ДНКметилгтрансфераза II 4.5димтилцитзин 4 4метилцитозин
5 5метилцитозин
i растительная цитозннС5ДНКметилтрансфераза
сигнал ядерной локализации
РКРкарбокснлаза фосфоенолпируват карбоксилаза
I процесс посгтранскршщионного замолкания генов
Нра рсстриктаза I
рсстриктаза
бадснозшн омоцистенн
адснозилмстнонпн
iX короткие интерферирующие РНК
процесс транскрипционного замолкания генов
ii i вариабельный участок цнтозинС5ДНК
мстилтрансфераз
убиквитинсвязывающие последовательности цитозинС5ДНКметил грансфераз
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Проведенный с помощью техники геномного секвенирования анализ сайта и в 5области гена кукурузы длиной п. Таким образом, островки генов растении проявляют структурнофункциональное сходство с островками генов позвоночных. Присутствие островков у позвоночных и растений коррелирует с большим размером их генома . В этой связи можно отметить, что островки очень редко встречаются в геноме холоднокровных позвоночных ii . С использованием техники флуоресцентной гибридизации i i показано, что островки сосредоточены преимущественно в раннсреплицирующихся областях хромосомы и полосах и особо сконцентрированы в Тполосе i . В геноме человека островки распределены неравномерно. Гак, ими обогащены хромосомы и , но их очень мало в хромосоме . Количество островков коррелирует с плотностью функциональных генов в соответствующих хромосомах. Механизмы защиты островков от метилирования изучены еще недостаточно. Возможны следующие способы такой защиты. Вопервых, это может быть структурное свойство самих островков. Так, обнаружено, что обогащенные последовательности плохо метилируются i vi i . Вовторых, в клетке могут существовать специфические для островков ДНКдеметилирующие ферменты . Предполагается, что островки помогают ядерным факторам клеток позвоночных и растений распознавать доступные для транскрипции районы хромосом i . Метилирование островков играет важную роль в переключении программ генетической экспрессии и в сопряженном процессе реорганизации структуры хроматина. До последнего времени объектами исследования были островки весьма ограниченного количества генов. В основе метода лежит гидролиз ДНК редкощепящей и чувствительной к метилированию рестрикционной эндонуклеазой . V1 с последующим Рмечением . V1ii с помощью их достраивания ДНКполимеразой. Меченые . VIфрагменты гидролизуют другой рестриктазой например, V и проводят деление продуктов гидролиза в первом направлении с помощью электрофореза в трубках с 0,8 агарозой. После гидролиза рестриктазой I i i фракционированных IV0 Vфрагментов проводится деление продуктов гидролиза электрофорезом во втором направлении на пластинах в 5 полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях. В результате с геля можно получить радиоавтограф, локализующий до нескольких тысяч индивидуальных пятен и отражающий состояние метилирования оетровков всего генома. С помощью метода проведен анализ состояния метилирования островков в геноме каждой из исследованных опухолей человека . Авторы установили, что в геноме опухолей, включая их ранние стадии развития, в среднем 0 островков из характеризуются специфической картиной их метилирования . Эти результаты свидетельствуют о принципиальной возможности идентификации многих новых генов, метилирование которых коррелирует с канцерогенезом. ЦитозинС5ДНКметилтрансферазы катализируют перенос метильной группы с аденозилметионина на остатки цитозина в специфических последовательностях дуплексной ДНК с образованием 5метилцитозина и аденозилгомоцисгеина. Эта реакция необратима. До года опубликовано более аминокислотных последовательностей цитозннС5ДНКметилтрансфераз , . Сравнительный анализ первичных структур прокариотических и эукариотических ДНКметилаз позволяет отнести их к одному классу ферментов, так как практически все цитозинС5ДНКметилтрансферазы имеют сходную структуру белковой молекулы. Все эти ферменты являются мономерными белками, отличающимися присутствием в их структуре ряда консервативных гомологичных областей, детерминирующих специфические ферментативные функции. У цитозннС5ДНКметилтрансфераз выделяют до консервативных участков, расположенных в строго определенной последовательности по длине аминокислотной цепи рис. При анализе последовательностей ДНКметилтрансфсраз используется номенклатура, предложенная Посфаи с соавторами i . Множественное сравнение первичных структур цнтозинС5ДНКмст илтрансфсраз показали связь основных функций этих ферментов с их консервативными районами v , в то время как функция сайтспецифнческого узнавания связана с вариабельным участком ii i , .