Пространственная организация ДНК в ядре и индуцированные ДНК-топоизомеразой II хромосомные перестройки

• Автор: Кантидзе, Омар Леванович
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение

1. Обзор литературы.

1.1. Пространственная организация ДНК в ядре

1.1.1. Уровни компактизации ДНК.

1.1.2. Доменная структура генома.

1.1.2.1. Ядерный матрикс.

1.1.2.2. Прикрепленная к ядерному матриксу ДНК.

1.1.2.3. Функции ДНК ядерного матрикса.

1.1.3. Хромосомные территории

1.2. Незаконная рекомбинация и хромосомные перестройки.
1.2.1. Двухчепочечные разрывы ДНК ДЦР и их репарация.
1.2.2. Кластеризация точек разрыва при транслокациях, ассоциированных с
лейкозами.
1.2.3. Структура хроматина как причина кластеризации первичных точек
разрыва.
1.2.4. Участие топоизомеразы II в незаконной рекомбинации
1.2.5. Пространственная организация ядра способствует образованию
определнных транслокаций.
Постановка задачи и методические подходы.
2. Материалы и методы
2.1. Материалы.
2.1.1. Клеточные линии.
2.1.2. Антитела
2.1.3. Химические реактивы
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование человеческих клеток.
2.2.2. Электрофорез в пул ьсирующем поле.
2.2.3. Приготовление препаратов ядерных .матриксов i i.
2.2.4. Иммуноцитохимия.
2.2.5. Определение относительной представленности различных участков
ДНК во фракции ДНК ядерного матрикса.
2.2.6. Метод остановки полимеразной цепной реакции
2.2.7. Иммунопреципитация хроматина
2.2.7.1. Растворы.
2.2.7.2. Методика
3. Результаты исследований
3.1. Подавление активности ДНКтопоизомеразы И приводит к
образованию двухцепочечных разрывов ДНК
3.1.1. Обработка клеток этопозидом приводит к образованию ДЦР
3.1.2. Количество ДЦР зависит от кон центрации этопозида.
3.1.3. Индуцированные ДЦР эффективно репарируются
3.2. РОЛЬ ЯДЕРНОГО МАТРИКСА В РЕПАРАЦИИ ДЦР, ИНДУЦИРОВАННЫХ ДНК
ТОПОИЗОМЕРАЗОЙ II
3.2.1. Индуцированные этопозидом фокусы гистона уН2АХ ассоциированы с
ядерным матриксом
3.2.2. Участки кластеризации то чек разрыва Ьсг ассоциирован ы с ядерным
матриксом
3.3. Негомологичное соединение концов ДНК, как механизм
ХРОМОСОМНЫХ ПЕРЕСТРОЕК, ИНДУЦИРОВАННЫХ ДНКТОПОИЗОМЕРАЗОЙ И
3.3.1. Цитологический подход.
3.3.2. Молекулярнобиологический подход
3.3.2.1. Выбор геномной модели.
3.3.2.2. Контрольные эксперименты.
3.3.2.3. Иммунопреципитацня хроматина.
4. Обсуждение результатов
Выводы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Уже достаточно давно в химиотерапии различных опухолей используются ингибиторы ДНКтопоизомеразы II, и нередки случаи, когда использование этих препаратов приводит к развитию вторичных лейкозов, в основе которых лежат те или иные хромосомные перестройки x . . Известно также, что обработка клеток высших эукариот ингибиторами топоизомеразы например, этопозидом или амсакрином может приводить к возникновению таких перестроек, как делении, ннссрции и транслокации i . i . Болес того, показано, что топоизомераза II обладает межмолекулярной ДНКлигазной активностью и может осуществлять незаконную рекомбинацию ДНК i vi , . Не мсисс важным нам представляется тот факт, что образование ковалентных комплексов топоизомеразы и ДНК, вызванное подавлением лигирующей активности топоизомеразы II, может приводить к запуску систем репарации двухцепочечных разрывов ДНК. В клетках эукариот существуют два основных пути репарации ДЦР гомологичная рекомбинация, играющая большую роль в клетках низших эукариот, и негомологичное соединение концов ДНК 1I, ii. Существует множество косвенных данных о том, что именно является основным механизмом репарации ДЦР, индуцированных топоизомеразой II i . i . Известно, что транслокации, ассоциированные с развитием некоторых лейкозов, имеют хара ДНКазе I и топоП. Ранее было показано, что основной мишенью ингибиторов тоиоизомеразы II является нерастворимая форма фермента, связанная с ядериым матриксом и взаимодействующая с участками прикрепления ДНК к матриксу. Исходя из представленных данных логично предположить, что связанная с ядерным матриксом топоизомераза может играть важную роль в запуске систем репарации ДЦР, в результате действия которых возможно появление различных транслокаций. II. Отдельное внимание уделяется роли ядерного матрикса в этом процессе. Основные принципы организации ДНК в составе хроматина были сформулированы ещ в конце х годов и с тех пор не претерпели существенных изменений i, i, . Основной единицей упаковки хроматина является нуклеосома. Гипотеза о существовании иуклеосом была впервые выдвинута Олинс i i, и Корнбергом , в году и стала большим шагом в понимании механизма компактизации ДНК в ядре эукариотической клетки. Нуклеосома состоит из 7 п. ДНК, намотанных на комплекс из восьми нуклеосомных гистоиов коровая частица. Рентгеноструктурный анализ нуклеосомы показал, что гистоновый октамер состоит из трех блоков центрального тетрамера Н3Н42 и двух периферических димеров Н2АН2В . Сборка нуклеосом начинается со связывания 1 п. ДНК с центральным тетрамером Н3Н42, дальнейшее присоединение димеров Н2АН2В приводит к увеличению участка ДНК, взаимодействующего с гистонами, до 7 п. . i ii, . ДНК примерно дважды а точнее 1. ДНК в 7 раз i v, . Коровыс частицы отделены друг от друга сегментами линкерной ДНК. Таким образом, общая длина участка ДНК, включенного в нуклеосому варьирует от 0 п. i, . В состав иуклеосомиой частицы входит четыре типа коровых гистонов ИЗ, Н4, Н2А, Н2В. Гистон любого класса можно условно поделить на два функциональных домена гистоновый фолд, необходимый для связывания ДНК и образования коровой частицы, и и Сконцевые участки хвосты, являющиеся основными мишенями посттрансляционных модификаций , , . Сконцевые домены полипептидных цепей, участвующие в гистонгистоновых взаимодействиях внутри коровой частицы, находятся преимущественно в виде аспирали с протяженным центральным спиральным участком, вдоль которого с двух сторон уложено по одной более короткой спирали i, . Все известные места обратимых посттрансляционных модификаций гистонов, происходящих на протяжении клеточного цикла или во время дифференцировки клеток, локализованы в гибких основных доменах их полипептидных цепей. Все классы гистонов подвергаются посттрансляционным модификациям ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, убиквитинирование и др. ДНК и другими ядерными белками v vv v i, i, .