Свойства, клонирование и секвенирование новой сайт-специфической никазы BspD6I

• Автор: Перевязова, Татьяна Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Пущино-на-Оке
• Количество страниц: 113 с.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений.

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Общее представление о системах рестрикциимодификации

1.2. Системы РМ типа 1.

1.3. Системы РМ типа III.

1.4. Системы РМ типа II

1.4.1. Ортодоксальный, НЕ и II подтипы

1.4.2. РМ системы подтипа II.

1.4.3. РМ системы подтипа II.

1.4.4. РМ системы подтипа ИТ
1.4.5. РМ системы подтипа II
1.4.6. РМ системы подтипа ИМ.
1.5. Пространственная структура эндонуклеаз рестрикции типа II
1.6. Структурная, функциональная и эволюционная связь между эндонуклеазами рестрикции и другими белками
1.7. Эндонуклеаза рестрикции .
1.8. Сайтспецифическис ыиказы
1.8.1. Общая характеристика сангспециических ииказ
1.8.2. Расщепление одной цепи ДНК как следствие неспособности
никаз к димеризации
1.8.3. Конструирование сайгспецифических никаз
1.8.4. Перспективы применения сайтспецифичсских никаз.
2. Экспериментальная часть
2.1 Материалы и оборудование
2.2. Методы.
2.2.1. Скрининг штаммов на наличие в них эндонуклеаз рестрикции
2.2.2. Выделение эндонуклеаз из штамма i i 6.
2.2.3. Электрофорезы в атрозном геле.
2.2.4. Реакции гидролиза ДНК.
2.2.5. Определение отимальных условий для проявления эндонуклеазной активности
2.2.6. Определение эндонуклеазной активности.
2.2.7. Проверка влияния на активность эндонуклеазы I
2.2.8. Фосфорилироваиие олигонуклеотидов.
2.2.9. Дефосфорилирование ДНК
2.2 Получение ДНКДНК дуплексов
2.2 Получение РНК ДНК гибридов.
2.2 Метилирование олигонуклеотидного дуплекса
2.2 Лигирование
2.2 Очистка фрагментов ДНК.
2.2 Выделение геномной ДНК i i 6.
2.2 Получение компетентных клеток
2.2 Трансформация компетентных клеток
2.21. Трансформация клеток при получении рекомбинантной плазмиды
2.22. Трансформация клеток при получении рекомбинантной плазмиды рКЕ4.
2.23. Трансформация клеток при получении
рекомбинантных плазмид 5 и рЕТЬ
2.2 Выделение плазмид из рекомбинантных клонов.
2.2 Полимеразные цепные реакции ПЦР
2.2 Получение делеционного варианта 39v
2.2 Определение точек расщепления на ДНК эндонуклеазами
2.2 Транскрипция i vi
2.2 Электрофорезы в полиакриламидных гелях ПААГ
2.2 Электроблотинг.
2.2 Анализ нуклеотидных последовательностей
3. Результаты
3.1. Выделение и 6.
3.2. Характеристика 6
3.2.1. Определение сайта узнавания .v6II
3.2.2. Определение точек расщепления ДНК эндонуклеазой
3.3. Характеристика эндонуклеазы 6
3.3.1. Идентификация как сайтснецифической никазы
3.3.2. Свойства никазы
3.3.3. Никаза 6 не расщепляет одноцепочечную ДНК
3.3.4. Никаза 6 чувствительна к метилированию сайта.
3.3.5. Никаза 6 не гидролизует ДНК в составе гибридов РНКДНК.
3.4. Клонирование сайтспецифической никазы
3.4.1. Клонирование фрагментов хромосомной ДНК i i 6
3.4.2. Клонирование и секвенированис гена никазы.
3.5. Новый метод гибридизациомного анализа ДНК на основе сайтспецифических никаз
4. Выводы.
Список публикаций по теме диссертации
Список цитируемой литературы


На сегодняшний день известны 4 сайтспецифические никазы, выделенные из природных штаммов. Одна из них, никаза 6 которой посвящена настоящая работа, найдена нами в термофильном штамме i i 6. Никазы не только расширят возможности уже существующих методов молекулярной биологии и диагностики один из таких методов гибридизационный анализ ДНК предложен в настоящей работе, но могут стать основой для создания новых методов. Одним из наиболее важных результатов генетического изучения бактерий и их бактериофагов явилось открытие рестриктируютцих эндонуклеаз ферментов, которые узнают специфические короткие нуклеотидные последовательности и разрезают обе цепи двойной спирали ДНК в сайте узнавания или на некотором расстоянии от него. В открытии этих ферментов ключевую роль сыграло наблюдение, сделанное в начале х годов в опытах Ьипа и ВеПаш 1, 2. Оно состояло в том, что бактериофаг, выращенный в клетках одного ш тамма, инфицируя клетки других штаммов этого же вида, часто растет очень плохо. Более того, выделенные после такой неэффективной инфекции бактериофаги в свою очередь плохо развиваются в исходных клетках. Этот феномен не связан с генотипом фага и был объяснен тем, что в фаге происходят какието модификации, контролируемые хозяином. Было высказано предположение 3, гго некий фаговый компонент, необходимый для репликации, специфическим образом модифицируется в клетке хозяина, так что фаг может совершить репликацию при повторном инфицировании того же штамма. Было доказано, что модифицируемым фаговым компонентом является ДНК, а неспособность фага реплицироваться в родственном штамме обусловлена деградацией инфицирующей фаговой ДНК. Расщепление ДНК инициируется внесением нескольких разрывов в высокоспецифичных сайгах, после чего происходит полная неспецифическая деградация. Модификацией, защищающей некоторые инфицирующие фаговые ДНК, а также геном клетки от разрывов, является штаммспецифическое метилирование ДНК. Рестрикция осуществляется эндонуклеазами, которые узнают аналогичные короткие специфические последовательности, лишенные метальных групп. Совокупность этих двух сайтспецифических активностей ДНКметилтрансферазной и эндонуклеазной получила название система рестрикциимодификации РМ. Впервые такие ферменты были выделены в i4 и 5. Это были ферменты системы РМ типа I. Вскоре был обнаружен первый фермент типа II, способный расщеплять ДНК в строго определенных точках. Это открытие послужило мощным толчком к развитию генетической инженерии и молекулярной биологии. До сих пор сайтсисцифические эндонуклеазы тина II являются одними из главных инструментов манипулирования с ДНК. В настоящее время системы рестрикциимодификации обнаружены практически у всех прокариот, и общее число известных систем превышает . Часто клетки содержат более одной системы РМ. Рекорд принадлежит штамму i i , . РМ 6. Согласно принятой номенклатуре 7, в название систем РМ входит первая буква рода бактерии, две первые буквы вида, обозначение конкретного штамма или экстрахромосомного элемента, кодирующего систему РМ, и номер системы в порядке обнаружения ее в штамме. В зависимости от локализации эндонуклеазной и мегилазной активностей на сложном белковом комплексе, на одной полипептидной цепи или на разных белках, от специфичности узнаваемая последовательность, от характера расщепления ДНК, а также кофакторов, необходимых для проявления активностей, системы РМ разделяют на четыре типа рис. I. Рис. Обобщенная схема строения систем РМ типов I, II, III и IV и кофакторы, необходимые или стимулирующие проявление эндонуклеазной активности. Ниже мы рассмотрим основные особенности этих систем. Следует отметить, что отнесение некоторых систем к типу IV пока не является общепринятым. В классификации Робертса, которой мы далее будем придерживаться, этот тип ферментов отнесен к подтипу 0. Большинство из известных систем типа I выделены из энтеробактсрий, хотя анализ секвенироваиных геномов свидетельствует о более широком распространении этих систем 8,9.