Изучение особенностей регуляции активности генов и контроля времени их репликации в домене альфа-глобиновых генов кур

• Автор: Клочков, Денис Борисович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 149 с. : ил.

Введение.

I. Обзор литературы.

1.1. Доменная гипотеза организации генома.

1.2. Домены открытого типа.

1.2.1. Регуляция экспрессии генов в доменах открытого типа.

1.2.2. Экспериментальные подходы к картированию доменов открытого типа

ЕЗ.Структурнофункциональная организация домена

альфаглобиновых генов кур.

1.4. СТСГзависимыс регуляторные элементы

1.4.1. Структура белка СТСБ

1.4.2. Функции СТСБзависимыхрегуляторных элементов

1.4.2.1. Транскрипционная репрессияактивация
1.4.2.2. Онхансерблокируюшая активность инсуляторов эукариот
1.4.2.3. РольСТСРзависимых элементов в организации геномных доменов.
1.4.2.4. Участие СТСРзависимых элементов в пространственной организации ядра
1.5. Время репликации
И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
.1. МАТЕРИАЛЫ
.1.1. Клеточные линии
II. 1.2. Бактериальные штаммы
Л. 1.3. Химические реактивы
.2. МЕТОДЫ.
.2.1. Ведение клеточных культур
.2.2. Временная трансфекция ДНК в эукариотические клетки.
.2.3. Анализ ферментативной активности репортерных генов.
.2.3.1. Определение активности хлорамфениколацетилтрансферазы с помощью тонкослойной хроматографии.
.2.3.2. Определение активности хлорамфениколаастилтрансферазы с помощью жидкостного сцинтилляционного счта.
.2.3.3. Определение активности ргалактозидазы
.2.4. Приготовление ядерных экстрактов
.2.5. Вестерн блот
.2.6. Связывание ДНК с экстрактом ядерных белков I VI.
.2.7. Эксперименты по задержки подвижности в полиакриламидном геле
I 1.2.8. ОТПЦ анализ
.2.9. Иммунопреципитация хроматина
.2 Бисульфитное секвеиирование
П.2 Флуоресцентная I I гибридизация I
I Приготовление препаратов клеток
Синтез гибридизационной пробы
Гибридизация.
II.2.I2. Проверка распределения клеток в культуре по фазам клеточного цикла методом анализа
II. 2 Другие методы.
III. Результаты исследований
1.1. Обнаружение зависимого сайленсера, расположенного рядом с промотором гена X
III.1.1. Обнаружение потенциального участка связывания в пределах
островка, расположенного в 5 фланкирующей области домена
альфаглобиновых генов кур
III. 1.2. взаимодействует i vi с изучаемой последовательностью ДНК.
И 1.1.3. Метилирование изучаемой последовательности ДНК предотвращает е
связывание с .
III. 1.4. Анализ статуса метилирования изучаемой связывающей последовательности ДНК в клетках эритроидного и лимфоидного происхождения.
1II.1.5. взаимодействует i viv с изучаемой последовательностью ДНК.
II 1.1.6. Изучаемый фрагмент ДИК обладает активностью сайленсера
III. 1.7. Активность обнаруженного сайленсера является СТСГзависимой.
1.1.8. Расстояние между у частком связывании СТСР и энхансером влияет на
активность сайленсера
III. 1.9. Определение позиции промотора гена X.
1.1 Обнаружение потенциального участка связывания СТСР в.
Зфланкирующей области домена алъфаглобиновых генов человека.
1.2. Определение времени репликации тканеспецифичного кластера
альфаглобиновых генов кур в клетках различного происхождения.
IV. Обсуждение результатов.
Выводы.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Некоторые из них транскрибируются например, образуя микроРНК, некоторые являются уникальными последовательностями интроны генов, другие многократно повторены микро и минисателлиты. В течение многих лет исследователей интересовал вопрос о том, как организованы сотни тысяч пар оснований хромосомной ДНК, сильно различающейся по функциональным характеристикам, в микрометровом ядре эукариотической клетки с тем, чтобы обеспечить надежность передачи и внутриклеточной реализации генетической информации, проявляющейся в упорядоченной во времени и безошибочной экспрессии генов. В течение многих лет ответ на этот вопрос давали в рамках доменной гипотезы организации эукариотического генома , i V, i . Согласно этой гипотезе, геном состоит из структурнофункциональных единиц, которые устроены и функционируют сходным образом. Функциональной единицей является геномная область, включающая ген или группу связанных генов со всем комплексом цисрегуляторных последовательностей. Юдинкова и Разин, Разин, . Структурной же единицей можно считать хроматиновый домен, который можно определить как достаточно протяженный участок генома, в рамках которого могут происходить изменения способа упаковки хроматиновой фибриллы, не распространяющиеся на фланкирующие области i . Разин, . Соответственно хроматиновый домен экспериментально можно детектировать как область с одинаковой чувствительностью к ДНКазе I или с одинаковым профилем модификаций гистонов. Оба этих параметра связаны определенным образом со способом упаковки хроматиновой фибриллы. Согласно доменной гипотезе организации эукариотического генома, оба типа доменов хроматиновый определенный по структурному принципу и геномный определенный по функциональному принципу полностью колокализуются. Механистически это можно представить так геном эукариот разделен на доменыпетли длиной 0 т. Участки закрепления петель на ядерном матриксе, так называемые элементы , могут обозначать границу геномного домена и содержать инсуяяторы, которые ограничивают область действия позитивных регуляторных элементов функциональная граница и препятствуют распространению репрессивных хроматиновых структур структурная граница. Такая точка зрения подкреплялась результатами изучения многочисленных доменов тканеспецифичных генов, для которых характерна полная колокализация доменов, картированных по функциональному и структурному принципам. X. Вайнтрауба i . ДНКазой I преимущественно перевариваются последовательности ДНК, кодирующие глобины, в ядрах, выделенных из куриных эритроцитов, в то время как те же глобиновые гены оставались устойчивыми к действию ДНКазы I при обработке ядер, полученных из куриных фибробластов и клеток мозга. Кроме того, нетранскрибирующиеся в этих типах клеток гены овальбумина были относительно устойчивы к действию ДНКазы I. Впоследствии, при изучении других доменов тканеспецифичных генов, было многократно показано, что тканеспецифичные гены и соответствующие им функциональные домены включающие функционально сцепленные гены, цисрсгуляторные элементы и межгенные пространства обладают повышенной чувствительностью к ДНКазе в тех типах клеток, где соответствующие гены экспрессируются. Это домены гена глицеральдегид3фосфатдегидрогеназы v . В человека vi . Все перечисленные домены являются достаточно протяженными более 0 т. ДНКазе только в определенных типах клеток. Переход от ДНКазачувствительной области к области, характеризующейся относительной устойчивостью к ДНКазе, происходит в пределах фрагмента ДНК протяженностью в несколько т. ДНКазачувствительных доменов. ДНКазе I конфигурацию протяженного хроматинового домена, включающего весь кластер бетаглобиновых генов и фланкирующие последовательности ДНК. Одновременно изменялось и время репликации тайминг репликации данной геномной области. Подобно большинству геномных областей, не содержащих активных генов, репликация бетаглобинового кластера с делегированной Зрсгуляторной областью происходила в конце фазы, в то время как активно работающий домен бетаглобиновых генов в эритроидных клетках реплицировался в начале фазы . Таким образом, можно говорить о структурнофункциональном сопряжении геномных и хроматиновых доменов. ДНКазе 1. ДНКазе I vv .