Анализ функциональной активности внутригенных промоторов E. coli с потенциальной возможностью инициировать транскрипцию, сонаправленную с синтезом мРНК

• Автор: Шавкунов, Константин Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 137 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. МНОГООБРАЗИЕ ФУНКЦИЙ, ВЫПОЛНЯЕМЫХ РНК. РЕГУЛЯТОРНЫЕ РНК

Обзор литературы

1.1. Избыточность транскрипции и возможность альтернативного кодирования

1.2. Многообразие функций, выполняемых РНК

1.3. Нетранслируемые РНК как новый тип регуляторов генной экспрессии

1.3.1. РНКинтерференция. Двухцепочечные РНК, как клеточный регулятор

Малые интерсЬепипуюшие РНК i 1

МикроРНК

РНК взаимодействующие с регуляторными белками группы ii i

Повторассоциироатшые малые интерферирующие РНК
1.3.2. Аптисмысловые РНК
1.3.3. Рибопереключатели
1.4. РНКрегуляторы прокариот
1.5. Белковые факторы транскрипции прокариот
как глобальный Фактор регуляции транскрипции
1.6. Методы поиска генов, кодирующих нетранслируемые РНК
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Бактериальные штаммы
2.2. Получение радиоактивно меченых олигодезоксинуклеотидов
2.3. Выделение ДНК из клеток .i с использованием кислого фенола
2.4. Амплификация индивидуальных фрагментов ДНК полимеразная цепная
реакция, ПЦР
2.5. Фракционирование ДНК методом электрофореза в полиакриламидном геле
2.6. Выделение фрагментов ДНК из полиакриламидного геля
2.7. Оценка эффективности комплексообразваиня промотор содержащих участков генома с РНКполимеразоЙ методом задержки ДНКбелковых комплексов при ПААГэлектрофорезе i
2.8. Тестирование матричной активности промоторов методом однократной инициации транскрипции i vi i
2.9. Выделение суммарной фракции клеточной РНК
2 Определение нуклеотидной последовательности ДНКфрагментов по МаксамуДжилберту
2 Исследование комплексов промоторов и РНКполимеразы методом футпринтинга i vi
2 Исследование транскрипционной активности предсказанных промоторов методом обратной транскрипции i viv
2 Рестрикция Д1 Iфрагментов и плазмиды для лигирования
2 Лигирование фрагмен тов ДНК, содержащих исследуемые промоторы,
в плазмиду
2 Приготовление компетентных клеток и трансформация
2 Анализ активности промоторов с использованием системы репортерной детекции методом флуоресцентной микроскопии
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выбор репрезентативных сонаправленных промоторов, перспективных для экспериментального тестирования
3.2. Проверка функциональной активности выбранных промоторов i vi
Исследование транскрипционной компетентности предсказанных промоторов Анализ транскрипииониой активности внутренних промоторов в гене
Анализ транскрипционной активности внутренних промоторов в гене v
3.3. Исследование функциональной активности промоторов из генетического
локуса гена
3.4. Сравнитсяьный анализ активности промоторных островков и нормальных промоторов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Было установлено участие разнообразных типов регуляторных РНК в фундаментальных процессах жизнедеятельности организмов всех трех доменов Эукариот, Прокариот и Архей. Выполняемые ими функции сопряжены с протеканием таких процессов, как репликация, поддержание структуры хроматина, защита клеток от вирусов, подавление активности мобильных генетических элементов, регуляция транскрипции, процессинг РНК, участие в трансляции и обеспечение стабильности мРНК и белков, а также целого ряда других событий в клетке , , , V . В год Уолтер Гилберт окончательно сформулировал в теорию ранее выдвинутое предположение о том, что на заре эволюции в неклеточных и ранних клеточных системах РНК могли выполнять не только матричные, но и структурные функции, а также осуществлять катализ различных реакций i, . По этой гипотезе, известной как гипотеза мира РНК, в ранних формах жизни РНК были первыми молекулярными машинами, и лишь с течением времени наблюдалось усложнение систем с формированием других полимеров для хранения и реализации информации в клетке. Возникла ДНК, двухнитсвая структура которой характеризуется более высокой стабильностью, а значит, лучше приспособлена для хранения и реализации генетического кода появились белки более разнообразные по своему строению, чем полирибонуклеотнды, и, как следствие, имеющие широкий спектр активности. Большая часть регуляторных РНК является короткими обычно 0 нуктеотидов одно и двухцепочечными полирибонуклеотидами, имеющими разнообразную пространственную структуру и различную степень эволюционной консервативности. Тем не менее, длина некоторых типов нстраислирусмых РНК эукариот, например, Xi принимает участие в инакгивации Ххромосомы и i обеспечивает функциональное выключение аутосомальных генов, молекулярный импринтииг составляет несколько тысяч нуклеотидов v , , , . Многие из известных на сегодняшний день РНК были обнаружены случайно при изучении явлений, не имеющих к ним непосредственного отношения. Соответственно, первые исследования, позволившие выделить новый класс РНК, не были системными и давали лишь отрывочные сведения о свойствах этих молекул. С конца х гг. РНК. В дальнейшем будут рассмотрены, по возможности, подробно, представители отдельных классов этих регуляторных молекул. РНКннтсрференция. Понятие РНКинтсрференции было введено для описания фуипы регуляторных процессов, в которых принимают участие короткие двухнитевые РНК, формирующие два класса малые интерферирующие РНК ii ii i, i, миРИК длиной нуклеотидов ит и микроРНК i, i, состоящие из нт. Молекулы этих РНК обнаружены в клетках большинства биологических объектов от 1рибов до млекопитающих. На основании филогенетического анализа установлено, что самые ранние предковые организмы, скорее всего, уже обладали подобием современной РНК интерференции, и в настоящее время ее отсутствие у некоторых групп считается не древней, а наоборот, недавно приобретенной в ходе эволюции особенностью i , . Малые интерферирующие РНК iI. Впервые феномен, вызванный действием миРНК, был описан в х годах, когда в ходе исследования, проводимого на круглом черве i I i, , была осуществлена попытка повысить уровень экспрессии отдельных генов, путем введения в клетку дополнительных их копий. При этом наблюдался стойкий обратный эффект, ген выключался. Примерно в то же время генетики, внедрявшие в клетки петунии фрагмент ДНК, содержащий ген, который отвечает за синтез красного пигмента, с целью получения лепестков более интенсивной окраски, столкнулись с неожиданным наблюдением. Многие цветы не только не приобретали более насыщенный оттенок, наоборот, они частично либо полностью теряли пигмент, или приобретали пятнистую окраску i . Виоследствие, аналогичное явление наблюдали у гриба i i, , однако его причина оставалась невыясненной. В середине х годов были предприняты попытки введения искусственно синтезированных небольших фрагментов РНК в клетки различных организмов. Внедрение двухцепочечных молекул эффективнее подавляло трансляцию мРНК гранскрипта по сравнению с действием комплементарных одноннтевых участков i .