Импорт тРНК в митохондрии дрожжей: роль предшественника митохондриальной лизил-тРНК-синтетазы и функция импортируемой тРНК в митохондриальном матриксе

• Автор: Каменский, Петр Андреевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список используемых сокращений.

1. Введение

2. Обзор литературы. Импорт макромолекул в митохондрии

2.1. Импорт белков в митохондрии

2.1.1. Сигнальные последовательности импортируемых белков

2.1.2. Претраислокационное разворачивание предшественников митохондриальных белков и их транспорт к митохондриальной поверхности.

2.1.3. Транслокационный комплекс внешней митохондриальной мембраны ТОМ

2.1.4. Встраивание белков во внешнюю мембрану митохондрий при помощи БАМкомплекса

2.1.5. Импорт белков в межмембраниое пространство митохондрий

2.1.6. Транслокационный комплекс внутренней митохондриальной мембраны Т1М и мотор транслокации.
2.1.7. Транслокационный комплекс внутренней митохондриальной мембраны Т1М и малые Типбелки межмембранного пространства
2.1.8. Экспорт белков из митохондриального матрикса
2.2. Импорт РНК в митохондрии.
2.2.1. Импорт тРНК в митохондрии простейших
2.2.2. Импорт тРНК в митохондрии растений
2.2.3. Импорт тРНК в митохондрии дрожжей.
2.2.4. Импорт РЫК в митохондрии млекопитающих
2.3. Импорт ДНК в митохондрии.
3. Материалы и методы исследования
3.1. Материалы
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Коммерческие наборы.
3.1.3. Антитела
3.1.4. Приборы и оборудование
3.1.5. Штаммы микроорганизмов
3.1.6. Питательные среды.
3.1.7. Генноинженерные конструкции
3.1.8. Олигонуклеотиды
3.2. Методы
3.2.1. Полимеразная цепная реакция ПЦР
3.2.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и дефосфорилироваиие
3.2.3. Лигирование
3.2.4. Определение нуклеотидной последовательности ДНК методом Сэнгера
3.2.5. Трансформация клеток .i
3.2.6. Трансформация клеток vii
3.2.7. Определение фенотипов штаммов дрожжей . vii
3.2.8. Измерение поглощения кислорода клетками
3.2.9. Исключение плазмиды, содержащей маркер 3, из дрожжевых клеток.
3.2 Выделение ДНК из клеток дрожжей.
3.2 Выделение митохондрий из клеток дрожжей.
3.2 Выделение дрожжевых митохондриальных РНК
3.2 Выделение суммарных дрожжевых тРНК в аминоацилированном состоянии
3.2 Нозсрнблот гибридизация
3.2 I vi Т7траискрипция
3.2 Радиоактивное мечение тРНК
3.2 Экспрессия рекомбинантных белков в клетках .i.
3.2 Очистка рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии на колонках с никельагарозой.
3.2 Вестернблот гибридизация.
3.2 Выделение белкового препарата, способного направлять
импорт тРНК в изолированные митохондрии дрожжей.
3.2 Транспорт радиоактивно меченных тРНК в изолированные митохондрии дрожжей
3.2 Митохондриальная трансляция i viv.
3.2 Метод задержки в геле.
3.2 Футпринтинг.
4. Результаты и обсуждение
4.1. Образование РНКбелкового комплекса, приводящего к импорту
тРНК в митохондрии дрожжей.
4.2. Изучение структуры РНКбелкового комплекса, приводящего к
импорту тРНК в митохондрии, методом футпринтинга.
4.3. Поиск участков ргеМэЫр, необходимых для направления импорта
тРНК в митохондрии.
4.4. Создание штамма дрожжей, в котором тРЛ1 не импортировалась
бы в митохондрии, и изучение фенотипического эффекта такого дефекта
Выводы.
Благодарности
Список цитируемой литературы


В случае дрожжей было показано, что из цитоплазмы в митохондрии импортируется два вида тРНК тРНКЛюсии i . РНКГлн i . Детальные механизмы импорта тРНК, а также функции импортируемой тРНК в митохондриальном матриксе, остаются неясными. Импорт тРНК является высокоспецифичным процессом, так как одна из двух изоакцепторных лизиновых тРНК тРНКЛизсии далее тРЛ1 направляется в митохондрии дрожжей, в то время как вторая тРНКЛтиии, тРЛ2 присутствует только в цитоплазме. Такое различие в локализации довольно близких тРНК может быть объяснено отличиями в структуре этих тРНК i . Помимо этого, в нашей лаборатории было показано участие трех растворимых цитоплазматических белков в импорте тРЛ1 в митохондрии. Прежде всего, тРЛ1 должна быть аминоацилирована с помощью цитоплазматической лизилтРНКсинтетазы, затем необходимо ее взаимодействие с предшественником митохондриальной лизилтРНКсшгтетазы v . Предполагается, что тРЛ1 импортируется в митохондрии, будучи связанной с этим белком. Однако присутствия амииоацилированной тРЛ1 и не достаточно для импорта тРЛ1 в митохондрии, что говорит о необходимости дополнительных белковых факторов, направляющих ее импорт, так называемых факторов импорта. Один из таких факторов был недавно охарактеризован как гликолитический фермент енолаза i . Роль этого белка в процессе импорта тРНК в митохондрии остается неясной. Вопрос о функции II в митохондриальном матриксе к настоящему моменту остается открытым. Существует предположение, что II принимает участие в митохондриальной трансляции. Однако, эта гипотеза подтверждена только косвенными экспериментами iv . Более того, митохондриальная лизиновая тРНК дрожжей с антикодоном , далее тРЛЗ способна узнавать оба лизиновых кодона ААА и в процессе митохондриальной трансляции. Целью данной работы являлось изучение формирования комплекса между тРЛ1 и , и с использованием полученных данных, создание штамма дрожжей, в котором тРЛ1 присутствовала бы исключительно в цитоплазме, и изучение фенотипического эффекта отсутствия тРЛ1 в митохондриях. заменен на ортологичный ген грибов ii. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Импорт белков в митохондрии играет важнейшую роль в биогенезе этих органелл, так как подавляющее большинство митохондриальных белков составляют именно импортируемые белки. Например, в митохондриальном геноме дрожжей vii закодировано всего 9 белков . Существует сложно организованная и до сих пор не изученная до конца система транспорта белков в митохондрии . Эта система направляет каждый индивидуальный белок, в зависимости от места его конечного расположения, в митохондриальный матрикс, в межмембранное пространство или в одну из митохондриальных мембран. Необходимо также отметить, что основными модельными объектами для изучения механизмов импорта белков в митохондрии служат . .. Общая схема импорта белков в митохондрии изображена на рис. Рис. Общая схема импорта белков в митохондрии. Пути импорта белковых предшественников показаны стрелками. Все предшественники импортируются из цитоплазмы СуО через внешнюю мембрану митохондрий ОМ при помощи ТОМкомплекса. Затем события могут развиваться по трем основным сценариям. Интегральные белки внешней мембраны встраиваются в нее при помощи БАМкомплекса. Предшественники митохондриальных белков, содержащие Ыконцсвую сигнальную последовательность, импортируются через внутреннюю мембрану митохондрий 1М при помощи Т1Мкомплекса в этом процессе также принимает участие транслокационный мотор РАМ. В результате предшественники проникают в митохондриальный матрикс Мх. Белки, содержащие внутренние сигнальные последовательности, при помощи Т1Мкомплекса встраиваются во внутреннюю мембрану митохондрий. Во всех трех сценариях участвуют малые Птбелки вТип межмембранного пространства 1МБ. ОХА 1комплекс осуществляет встраивание белков митохондриального матрикса во внутреннюю мембрану.