Анализ взаимодействия генов при скрещивании низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 и высокопродуктивного штамма вируса гриппа человека

• Автор: Кочергин-Никитский, Константин Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 148 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Молекулярная биология и генетика вируса гриппа А.

1.1. Таксономия.

1.2. Геном вируса гриппа Л

1.3. Вирион вируса гриппа А и белки, входящие в его состав

1.4. Стадии репродукции вируса гриппа А.

1.4.1. Проникновение в клетку

1.4.2. Транскрипция и репликация РНК.

1.4.3. Регуляция экспрессии генов вируса гриппа
1.4.4. Сборка вириона и выход из клетки
Глава 2. Реассортация у вирусов гриппа А
2.1.Сегментированность генома вируса гриппа как основа реассортации
2.2. Контроль упаковки вирусного генома в вирион
2.3. Реассортация вирусов гриппа в природных условиях.
Глава 3. Использование рсассортации для исследования взаимодействия генов и для получения вакцинных штаммов.
3.1. Области применения рсассортации в лаборатории
3.2. Функциональное взаимодействие НА и ЫА и баланс их активностей.
3.3. Получение вакцинных штаммов на основе реассортантных вирусов гриппа.
ЧАСТЬ И. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Глава 1. Материалы и методы.
1.1. Вирусы.
1.2. Очистка и концентрация вирусов.
1.3. Инактивация вируса глютаральдегидом
1.4. Антитела.
1.5. Получение реассортантов
1.6. Реакция гемагглютинации
1.7. Иммунологические реакции.
1.8. Количественное определение вирусных белков в гельэлектрофорезе. .
1.9. Определение аффинности НА вирусов к сиаловым субстратам
1 Постановка полимеразной цепной реакции
1 Электрофорез в агарозном геле.
1 Автоматическое секвенирование.
1 Заражение мышей.
1 Опыты перекрестной иммунной защиты на мышах.
1 Статистическая обработка результатов экспериментов
Глава 2. Получение реассортантных вирусов
Глава 3. Вирулентность реассортантов для мышей.
Глава 4. Сравнение антигенной специфичности реассортантов, содержащих ген НА вируса ii 52, с вирусом, содержащим ген НА современного вируса 51.
4.1. Иммунологические реакции.
4.2. Опыты перекрестной иммунной защиты.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Проведена оптимизация генного состава реассортанта посредством обратного скрещивания, существенно повысившая продуктивность вируса. Полученные реассортанты обладают некоторыми характеристиками штамма, пригодного для получения инактивированной вакцины они безопасны, поскольку не содержат высокорасщепляемого НА, придающего вирусам Н5 такую высокую вирулентность, но при этом они высокопродуктивны, хотя и уступают в этом отношении вирусуродителю i8 11. Н5, обладающего пандемическим потенциалом. Данные указывают на необходимость детальной антигенной характеристики низкопатогенных вирусов подтипа Н5, выделяемых в Евразии, в особенности на территории Российской Федерации, в связи с потенциальной возможностью их использования в качестве вирусовродигелей для получения реассортантных вакцинных штаммов. При использовании таких вирусов отпадает необходимость в применении дорогих и сложных генноинженерных методов для снижения патогенности вируса путем устранения пептида в участке разрезания НА. Несмотря на неполное соответствие антигенной специфичности НА низкопатогенных вирусов подтипа Н5 и высокопатогенных вирусов Н5И1, реассортанты такого типа могли бы использоваться в качестве баррикадной вакцины по Э. Килбурну для уменьшения смертности при первой волне пандемии. Важным аспектом нашей работы является повышение продуктивности рсассортантов вирусов гриппа человека и птиц в результате оптимизации их генного состава. Применение для этой цели метода обратного скрещивания может оказаться полезным для получения высокопродуктивных штаммовкандидатов для инактивированных и субъединичных вакцин против вероятного возбудителя пандемии гриппа. Такой подход может быть применен не только к реассортангам, полученным методом скрещивания и селекции, но и к вирусам, полученным с использованием генноинженерной техники, для оптимизации их генного состава. Таким образом, полученные результаты расширяют представления о взаимодействии генов вирусов гриппа А при реассортации и должны учитываться в будущем при проведении исследований практического характера, направленных на создание и усовершенствование вакцинных штаммов, которые будут направлены против вероятных возбудителей будущих пандемий 1риппа. ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ГЛАВА 1. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА ВИРУСА ГРИППА А. Л. Таксономия. Вирусы фиппа относятся к семейству xvii. Это покрытые оболочкой вирусы с сегментированным геномом в виде одноцепочечной негативнонитевой РНК, названной так изза того, что она служит мафицей для синтеза мРНК, которую принято считать позитивнонитевой. Семейство xvii от греческого прямой, стандартный, и туха слизь названо так изза их способности связываться с клетками слизистых оболочек, и чтобы подчеркнуть их отличие от другого семейства негативнонитевых РНКвирусов, тоже поражающих слизистые оболочки и отнесенных в семейство xvii. Среди 5 родов семейства xvii 3 рода относятся к вирусам фиппа Ivi , Ivi В, Ivi С, включающие соответственно вирусы фиппа А, вирусы гриппа В и вирусы фиппа С. Англоязычное I происходит от латинского ii, обозначающего влияние, первоначально использовавшегося изза того, что эпидемии считали следствием влияния сверхъестественных сил 9. Вирионм вируса гриппа А электронная микроскопия . РВ1. РВ2. Схема 1. Строение вириона вируса гриппа А 9. Геном вируса гриппа А. Геном вирусов гриппа сегментирован. В состав генома вирусов гриппа А входит 8 сегментов однонитевой РНК, имеющей негативнонитевую полярность. РНКсегментам присвоены номера в соответствии с их подвижностью при анализе посредством электрофореза в полиакриламидном геле. Все сегменты имеют почти одинаковые Зконцевые нуклеотидов и одинаковые 5концевые нуклеотидов, которым предшествуют олигоуридиловые участки от 6 до 8 уридиловых остатков. РНКсегменты не кэппированы то есть не имеют метилированного гуанозилового остатка на 5конце, присоединенного пирофосфатной связью и не полиаденилированы на Зконце 2, 1, 1,6.