Летальный фактор из Bacillus anthracis : субстратная специфичность и механизм действия

• Автор: Захарова, Мария Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 113 с. : ил.

Введение
Глава 1. Сибирская язва молекулярные механизмы ннфекцни и подходы к лечению. Обзор литературы

1.1 Болезнь Сибирская язва

1.1.1 Патогенез.

1.1.2 Факторы вирулентности.

1.1.2.1 ПА.
1.1.2.2 ЛФ.
1.1.2.3 ОФ.

1.1.3 Токсины СЯ.

1.1.4 Проникновение токсинов в клетку

1.1.4.1 Рецепторы.

1.1.4.2 Сборка и гранслокация токсинов
1.1.5 Действие токсинов внутри клетки
1.1.5.1. Расщепление МАРКК киназ с помощью ЛФ.
1.1.5.2 Повышение уровня цАМФ с помощью ОФ
1.1.6 Клеточные мишени для токсинов СЯ.
1.1.6.1 Токсины СЯ и врожденный иммунитет.
1.1.6.1.1 ЛТ и апоп гоз макрофагов
1.1.6.1.2 ЛТ блокирует активацию макрофагов.
1.1.6.1.3 ЛТ и нейтрофилы.
1.1.6.1.4 Токсины СЯ и дендритные клетки
1.1.6.2 Токсины СЯ и приобретенный иммунитет
1.1.6.2.1 Токсины СЯ и ДК.
1.1.6.2.2 Токсины СЯ и Тклстки.
1.1.6.2.3 Токсины СЯ и Вклетки.
1.1.6.3 Действие токсинов на нсимунные клетки.
1.1.6.3.1 Токсины СЯ и эндотелиальные клетки
1.1.6.3.2 Токсины СЯ и эритроциты.
1.1.7 Современные подходы к лечению болез1ги СЯ
1.1.7.1 Вакцины.
1.1.7.2 Антибактериальные лекарства.
1.1.7.3 Антитоксины.
1.1.7.3.1 Антитела к токсинам СЯ
1.1.7.3.2 Свободные рецепторы.
1.1.7.3.3 Блокирование созревания и сборки токсинов.
1.1.7.3.4 Предотвращение транслокации токсинов
1.1.7.3.5 Использование аналогов субстратов в качестве антитоксинов.
1.1.7.3.6 Иизкомолекулярные ингибиторы эффекторных субъединиц.
1.2 Методические подходы к получению ингибиторов металопротеаз, имеющих медицинское значение.
1.2.1 Структура активного центра ЛФ. Дизайн ингибиторов с помощью структурных исследований.
1.2.2 Дизайн ингибиторов с помощью ЯМР.
1.2.3 Дизайн ингибиторов с помощью массспектроскоиии
1.2.4 Селекция ингибиторов с номощыо бионеоргаиического подхода.
1.2.5 Механизм действия металлопротеаз. Дизайн ингибиторов на основе информации
о механизме работы фермента
1.2.6 Получение ингибиторов путем широкомасштабного скрининга на основе активности фермента
1.2.6.1 Подбор эффективного субстрата для измерения активности протеазы
1.2.6.1.1 Использование специфичных субстратов протсаз
1.2.6.1.2 Подбор субстрата комбинаторным способом.
1.2.6.1.2.1 Контекстзависимые субстратные библиотеки.
1.2.6.1.2.1 Смешанные контекстзависимые библиотеки субстратов
1.2.6.1.2.3 Анализ библиотек пептидных субстратов методом секвенирования.
1.2.6.1.2.4 Иммобилизованные субстратные библиотеки.
1.2.6.1.2.5 Сканирующие синтетические комбинаторные библиотеки
1.2.6.1.2.6 Субстратный фаговый дисплей.
1.2.6.1.2.7 Другие стратегии биологического субстратного дисплея
1.2.6.2 Создание системы детекции активности протеазы для широкомасштабного скрининга ингибиторов.
1.2.6.2.1 Подбор оптимальных репортеров для детекции работы фермента i vi.
1.2.6.2.2 Разработка системы детекции протсаз i viv.
Заключение.
Глава 2 Результаты и обсуждении.
2.1 Исследование субстратной специфичности ЛФ методом фагового дисплея.
2.1.1 Конструирование и скрининг фагдисплейной библиотеки.
2.1.2 Анализ структуры субстратов после первого этапа скрининга
2.1.3 Создание системы детекции активности ЛФ с использованием флуоресцентных белков.
2.1.4 Оценка эффективности субстратов ЛФ после первого этапа скрининга.
2.1.5 Создание и скрининг удлиненной библиотеки субстратов.
2.1.6 Исследование расщепления субстратов ЛФ после скрининга расширенной библиотеки.
2.1.7 Определение положения сайтов расщепления полученных субстратов.
2.1.8 Определение влияния т очечных мутаций в последовательности субстрата на эффективность взаимодйствня с ЛФ.
2.2 Исследование механизма ферментсубстратных взаимодействий ЛФ с помощью прсдстационарной кинетики
2.2.1 Взаимодействие ЛФ с субстратами группы ЛФ
2.2.2 Изучение ингибирования ЛФ
2.2.3 Протеолитическое расщепление субстрата мутантными формами ЛФ с измененным активным центром
2.2.4 Взаимодействие ЛФ с субстратом С, отобранным из фаговой библиотеки
2.2.5 Активация апофермепта ЛФ с помощью двухвалентных металлов
Заключение.
Глава 3. Практическая часть
Материалы
Методы.
Выводы.
Список литературы


После достижения критической стадии терапия антибиотиками становится неэффективной , и в большом проценте случаев смерть наступает в течение часов после этого момента. Лечение антибиотиками на ранних стадиях СЯ приводит к полному выздоровлению, но несвоевременно поставленный диагноз и запоздалая терапия могут стать причиной серьезных осложнений и гибели пациента. Факторы вирулентности. В. ашИгаав производит ряд факторов вирулентности, благодаря которым происходит проникновение инфекции в организм и развитие болезни 5, . Гены, ответственные за развитие заболевания, расположены на двух плазмидах рОХ1 и рОХ2. ОХ2 кодирует белки, вовлеченные в биосинтез поли Эглутаминовой оболочки, позволяющей делящимся бактериям избежать поглощения фагоцитами . ОХ1 несет гены, кодирующие факторы вирулентности ПА, ЛФ и ОФ. Г1А связывается с рецепторами на клеточной мембране и обеспечивает транслокацию ЛФ и ОФ во внутриклеточные компартменты. Протсктивный антиген ПЛ, получивший свое название изза использования при разработке вакцин, является центральным компонентом токсинов СЯ. Помимо обеспечения интернализации ЛФ и ОФ, ПА так же способен к транслокации искусственных химерных белков, содержащих сигнал связывания с ПА, и может использоваться как компонент системы доставки белков в клетку . Мономерный ПА содержит 4 структурных домена, состоящих преимущественно из антипараллельных р блоков рис 1А. Домен 1 координирует 2 иона Са2 и содержит сайт узнавания для протеаз активации см ниже. Домен 2, ответственный за формирование поры в плазматической мембране, содержит большую гибкую петлю, вовлеченную во взаимодействие с мембраной и в связывание с рецептором. Маленький домен 3 отвечает за олигомеризацию ПА. Домен 4 участвует в связывании с рецепторами , . ЛФ является высокоспецифичной 2зависимой металлопротсазой код фермента 3. I , которая расщепляет последовательности киназ семейства МАРКК от английского i iv i i i вблизи их конца. Анализ трехмерной структуры этой иротеазы указывает на то, что, иовидимому, ЭВ0ЛЮЦИШ0 ген ЛФ появился в результате процессов дупликаций, мутаций и слияния различных генов эго привело к появлению протеазы с крайне высокой специфичностью. ЛФ крупный белок весом кДт включает в себя 4 домена, состоящих, воосновном, из асниралей рис. Б. Домен 1 связывает ПА, он необходим для проникновения ЛФ внутрь клетки , . Домен 2 напоминает но структуре АДФрибозилирующий домен VI2 токсина из i , активный сайт которого изменен в случае В. Домен 3, так называемый спиральный пучок, встроен в домен 2 и, по всей видимости, состоит из повторов структурных элементов домена 2. Домен 4 является каталитическим центром и имеет некоторое сходство с доменами других 2 содержащих металлопротеаз рис. Ь. Каталитический домен содержит последовательность НЕХХН в своем активном сайте, которая является характерной чертой металлопротсиназ и участвует в связывании иона 2. Однако, общая структура каталитического домена уникальна и не имеет гомологов. Рисунок 1. Кристаллическая структура компонентов токсинов сибирской язвы Л ПЛ. Б ЛФ. ОФ в комплексе с качьмодулином. Домен I. ЛФ является нетипичной металлопротеазой еще и потому, что не требует активации, сопровождающейся отрезанием пропептида, что обычно для других ферментов этой группы. ОФ является Са2кальмодулин зависимой аденилатциклазой АЦ. Интересно, что активность ОФ превышает таковую для АЦ млекопитающих примерно в раз . Увеличение уровня клеточного цАМФ нарушает водный баланс и препятствует нормальному функционированию сигнальных каскадов в клетке. ОФ состоит из Iконцевого ПАсвязывающего домена, центрального каталитического домена и Сконцевого спирального домена , рис. В. концевой домен гомологичен по структуре и функциям 1 домену ЛФ . Каталитический домен структурно сходен с доменами других бактериальных АЦ токсинов, например токсинов i СуаА и i x. Спиральный домен располагается напротив каталитического домена в инактивированном состоянии. Кальмодулин СаМ встраивается между этими двумя доменами, раздвигая их, что приводит к повороту одного домена относительно другого примерно на градусов рис.