Негистоновые белки хроматина ячменя

• Автор: Чарский, Валерий Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1984
• Место защиты: Одесса
• Количество страниц: 219 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1.Общие сведения о составе хроматина

1.2.Определение и классификация НГБ.

1.3.Методы выделения НГБ

1.4.Гетерогенность и тканевая специфичность НГБ.

1.5.Локализация и метаболизм НГБ

1.6.Модификации НГБ и участие НГБ

в хромосомном метаболизме.

1.7.Биологическая роль НГБ

1.8.Белки, активирующие транскрипцию хроматина.
1.9.Белки, ингибирующие транскрипцию ДНК. ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1.Характеристика используемого материала.
.
2.2.Выделение хроматина растений
2.2.1.Проращивание семян
2.2.2.Выделение хроматина.
2.2.3.Выделение хроматина из ядер ячменя
2.3.Выделение негистоновых белков
хроматина растений
2.3.1.Диссоциация хроматина и
удаление ДНК
2.3.2.Разделение суммарных белков хроматина на гистоны и НГБ.
2.3.3.Концентрирование и хранение препаратов НГБ.
2.4.Выделение ДНК и определение физикохимических характеристик
2.4.1.Фрагментирование ДНК
2.4.2.Определение молекулярной массы
фрагментов ДНК ультрацентрифугиро. . ванием в сахарозном градиенте
2.5.Фракционирование ДНК
2.6.Приготовление ДНКцеллюлозных колонок.
2.7.Аффинная хроматография на ДНКцеллюлозе 2.8.Электрофорез НГБ в полиакриламидном геле
в присутствии ДДС
2.9.Определение активности протеолитических ферментов и их ингибиторов, входящих в
состав НГБ
2.9.1.Определение активности протеолитических ферментов
2.9.2.Определение ингибиторов трипсин
подобных ферментов
2Аналитические методы.
21.Химический анализ хроматина
22.Определение концентрации белка.
23.Определение концентрации ДНК
24.Определение концентрации РНК
2Мечение негистоновых белков
хроматина С 1
ГЛАВА III. ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫДЕЛЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ
3.1.Характеристика препаратов хроматина
3.2.Характеристика препаратов ДНК.
3.3.Характеристика препаратов НГБ.
ГЛАВА 1У. БИОЛОГИЧЕСКАЯ СПЕЦИФИЧНОСТЬ НГБ
ХРОМАТИНА ЯЧМЕНЯ.
4.1.Межвидовая специфичность НГБ хроматина высших растений
4.2.Внутривидовая специфичность НГБ
хроматина ячменя.
4.3.Онтогенетическая специфичность НГБ
хроматина ячменя.
4.4.Специфичность ядерной протеиназы,
входящей в состав НГБ хроматина ячменя
4.5.Внутригеномная специфичность НГБ
хроматина ячменя.
4.5.1.Выбор матрицы
5.2.Иммобилизация ДНК
4.5.3.Выбор условий элюирования
4.5.4.ДНКцеллюлозная хроматография
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ
ЛИТЕРАТУРА


Эта лабильно связанная фракция НГБ обогащена фосфопротеинами, отличающимися от фосфопротеинов, остающихся после экстракции в составе прочно связанных НГБ ii, и выполняет определнную роль в регуляции транскрипции хроматина . Группа НГБ, экстрагируемая при диссоциации 0,2,ОМ самая многочисленная и наименее изученная. О е характеристиках будет упомянуто в дальнейшем изложении. ДНК при этих условиях , i, . НГБ, которые диссоциируют ЗМ 5М мочевиной, способны специфически взаимодействовать с гомологичной ДНК , , , причм с е транскрипционно активными участками , i, . , , . . ДНК, взаимодействующие с ними, от нуклеаз. Определнная часть прочно связанных белков участвует во взаимодействии ДНК с матриксом ядра и до НГБ состоят из белков матрикса , , i, . Показано, что эти белки не удаляются из ядра 2М и число НГБ, входящих в ядерный матрикс, не менее . Они обогащены полипептидами с молекулярной массой кд и имеют повышенное сродство к АТбогатым участкам. Предполагается, что эти НГБ связаны с неактивными АТбогатыми участками в хромомерах. Вероятно, к этому классу также относятся наиболее сильно связанные с ДНК белки, найденные в препаратах ДНК животных и растительных организмов , , i . Эти белки не отделяются от ДНК при любых условиях депротеинизации и могут быть. ДНК. Определнная часть белков остатся ассоциированной с нуклеотидами и олигонуклеотидами. Молекулярная масса этих белков, по данным электрофореза, равна кд. Предполагается, что эти белки представляют класс ковалентносвязанных НГБ, играющих определнную роль в организации хроматина, например, поддержке суперспиральной структуры. К категории прочно связанных белков также можно отнести два белка, остающихся связанными с ДНК после диссоциации 2ЗМ 5М мочевиной в хроматине клеток , , и печени крысы i . Основной, из этих двух, белок растворим в додецилсульфате натрия С ДДСНа и феноле, но не растворяется в 2ЗМ 5М мочевине в присутствии или отсутствии 2меркаптоэтанола и в 4 гуанидин хлориде. Хроматин ретикулоцитов также содержит этот белок С i, , . Так как фракция НГБ, стимулирующая транскрипцию гена глобина, диссоциирует от ДНК при высокой концентрации соли и мочевины . Для белка из хроматина клеток i была показана , , ассоциация его с неактивным хроматином. При экстракции фенолом хроматина ретикулоцитов этот НГБ являлся одним из основных белков Vii . ЗМ этот белок во фракции НГБ хроматина ретикулоцитов отсутствовал , . Показано, что этот белок связан с уникальными последовательностями ДНК. Методы выделения НГБ. Методы выделения НГБ состоят из двух основных стадий отделение белков хроматина от ДНК и разделение гистонов и НГБ. Иногда используют экстрацию гистонов из хроматина разбавленными минеральными кислотами с последующим выделением НГБ из дегистонизованного нуклеопротеина. Мхлориде цезия ii, , при ,6 для отделения белков от ДНК, Подобный метод был применн и для хроматина с экстрагированными гистонами i, , , Ещ один метод выделения НГБ из дегистонизованного хроматина основан на гидролизе ДНК дезоксирибонуклеазой с последующим осаждением белков 0,4н хлорной кислотой ,, i, i, , Одним из наиболее широко используемых методов выделения при изучении гетерогенности НГБ является экстракция дегистонизованного хроматина ионными и неионными детергентами с последующим удалением ДНК ультрацентрифугированием, Марушиге и соавторы i ,, диссоциировали дегистонизованный хроматин печени крысы 1 ДДСНа Затем концентрация ДДСНа понижалась до 0,1 и ДНК удалялась центрифугированием, Выход НГБ составлял , В дальнейшем эта методика была. НГБ методом электрофореза i, , i, , , , i ,, i, , , Неионный детергент тритон XI также использовали при выделении НГБ из печени и мозга крысы vi, i, .