РНК-полимераза бактерий: иммунология и молекулярная генетика

• Автор: Никифоров, Вадим Георгиевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1983
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 291 c. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. РНКПОЛИМЕРАЗА Е. со СТРУКТУРА И НАЧАЛЬНЫЕ

СТАДИИ ЦИКЛА ТРАНСКРИПЦИИ.

1.1.Структура РНКполимеразы .

1.1.1. Очистка .

1.1.2. Субъединичный состав

1.1.3. Самосборка.

1.1.4. Четвертичная структура

1.1.4.1. Ограниченный протеолиз.

1.1.4.2. Сшивки бифункциональными реагентами

1.1.4.3. Электронная микроскопия
1.1.4.4. Малоугловое нейтронное и рентгеновское рассеяние в растворе
1.2. Начальные стадии цикла транскрипции .
1.2.1. Общая характеристика.реакций, катализируемых РНКполимеазой . .
1.2.2. Цикл транскрипции .
1.2.3. Связывание с ДНК
1.2.3.1. Свойства комплексов РИКполимеразы с ДНК. . .
1.2.3.2. Поиск промотора
1.2.3.3. Нуклеотидная последовательность промоторов. .
1.2.3.4. Контакты .РНКполимеразы с промоторами
1.2.4. Инициация .
1.2.4.1. Выбор стартовой точки
1.2.4.2. Изменение свойств комплекса РНКполимеразы
с ДНК после начала синтеза РНК.
1.2.4.3. Абортивная инициация.
1.2.4.4. Рифампицин ингибитор продуктивной инициации.
ГЛАВА 2. СТРУКТУРНАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ГОМОЛОГИЯ
РНКПОЛИМЕРАЗ РАЗНЫХ БАКТЕРИЙ.
2.1. Сравнение РНКполимераз мезофильной В. со
И термофильной в. Уаегим
2.2. Сравнение структурнофункциональных свойств бактериальных РНКполимераз литературные данные . .
2.2.1. Субъединичный состав
2.2.2. Гомология субъединиц
2.2.3. Узнавание промоторов в чужеродной ДНК .
ГЛАВА 3. ЭВОЛЮЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ СТРУКТУРЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
РНКПОЛИМЕРАЗ
3.1. Пептидные карты оСсубъединицы.
3.2. Участки субъединиц, выступающие на поверхность минимальной РНКполимеразы
3.3. Участки субъединиц, скрытые внутри молекулы РНКполимеразы.
3.4. Консервативность структуры центра связывания ДНК. . .9 ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ СУБЬЕДИНИЦ РНКПОЛИМЕРАЗЫ
С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ .
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ СУБЬЕДИНИЦ РНКПОЛИМЕРАЗЫ С ПОМОЩЬЮ ХОЛОДОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ МУТАЦИЙ .
5.1. Получение холодочувствительных мутантов
5.2. Идентификация субъединиц, затронутых мутациями. . . .
5.3. Влияние холодочувствительных мутаций на функциональные свойства РНКполимеразы.
5.3.1. Элонгация
5.3.2 Открывание промоторов на ДНК фага Т
5.3.3. Стабильность закрытых комплексов РНКполимеразы
с ДНК фага Т
5.3.4. Влияние сверхспирализации .
5.3.5. Связывание с разными ДНК. .
5.4. Итоги изучения холодочувствительных мутантных РНКполимераз . .
5.5. Термочувствительные мутации в генах РНКполимеразк. .
5.6. Амбермутации в генах РНКполимеразы
ГЛАВА 6. ИДЕНТИФИКАЦИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН ПРИ МУТАЦИЯХ
УСТОЙЧИВОСТИ К РИФАМПИЦИНУ
ГЛАВА 7. МЕТОДИКИ ЭКСПЕРИМЕНТОВ
7.1. РНКполимераза
7.1.1. Получение экстрактов для определения
активности РНКполимеразы
7.1.2. Получение экстрактов для иммунологического сравнения РНКполимераз
7.1.3. Определение концентрации белка
7.1.4. Очистка РНКполимераз
7.1.5. Разделение субъединиц и реконструкция.
7.1.6. Иодирование.
7.1.7. Пептидные карты.
7.1.8. Определение активности РНКполимеразы.
7.1.9. Определение связывания РНКполимеразы с ДНК . . .
7.2. ДНК . . .
7.2.1. Получение фаговых ДНК.
7.2.2. Получение плазмидных ДНК
7.2.3. Определение контактов с РНКполимеразой
7.2.4. Определение нуклеотидной последовательности . . .
7.3. Иммунология .
7.3.1. Иммунизация кроликов
7.3.2. Получение моновалентных антител
7.3.3. Приготовление иммуносорбентов
7.3.4. Связывание меченых препаратов РНКполимеразы
с иммуносорбентами.
7.3.5. Получение гибридом.
7.3.6. Радиоиммунологический анализ.
7.3.7. Реакция с антигенами, иммобилизованными
на нитроцеллюлозе
7.4. Мутагенные обработки.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


В работе 0 была использована просвечивающая электронная микроскопия контрастирующее вещество уранилацетат. Была предложена модель, состоящая из четырех морфологически попарно одинаковых субъединиц. Две из них имеют длину ,5 нм и диаметр 2,5 нм повидимому р и р , а две другие длину 8 нм и диаметр 2 нм повидимому А . Большие субъединицы располагаются под углом друг к другу, образуя при проекции на плоскость Хобразную структуру. Две малые субъединицы помещаются в тупых углах Хобразной структуры перпендикулярно ее плоскости рис. Микрокристаллы минимальной РНКполимеразы термофильной бактерии Ткгти аъгтор1лл были исследованы электронномикроскопически с применением техники оптической дифракции и оптической фильтрации полученных изображений 1. Разработана модель, по которой молекула имеет форму вытянутого цилиндра длиной нм и диаметром 6,4 нм и состоит из двух больших субъединиц р ир вытянутой формы, расположенных параллельно и слегка перекрученных. Димер субъединиц расположен в центре комплекса рис. Малоугловое нейтронное и рентгеновское рассеяние. Ранние исследования с применением метода малоуглового рентгеновского рассеяния показали, что молекула РНКполимеразы имеет вытянутую форму с соотношением осей и радиусом вращения 6,2 нм 2. Первую информацию о взаимном расположении субъединиц дало изучение нейтронного рассеяния на препаратах РНКполимеразы, в
Рис. Электронномикроскопические модели четвертичной сруктуры минимальной РНКполимеразы А , Б 0, В 1. Метод позволяет измерить расстояние между центрами масс субъединиц и составить представление о форме субъединиц. Были изучены полная и минимальная РНКполимеразы и построена модель, изображенная на рис. По этой модели проекция молекулы минимальной РНКполимеразы на плоскость представляет собой треугольник, в основании которого лежит димер оСсубъединиц. Присоединение ссубъединицы не меняет общей пространственной организации молекулы. Большие субъединицы в рамках этой модели представляют собой вытянутые, слегка изогнутые тела бананоподобной формы, контактирующие только с одного конца. Субъединица контактирует с обеими большими субъединицами, но предпочтительно С . Уточнение и детализация этой модели были проведены с помощью малоуглового рентгеновского рассеяния. Исследовали изолированную субъединицу 5, димер 6, промежуточный комплекс гр, и минимальную РНКполимеразу 7, полную РНКполимеразу 8, димер полной и олигомеры минимальной РНКполимеразы 9. Изолированные р и субъединицы не исследовали изза их склонности к агрегации. При рассмотрении результатов этой серии работ следует иметь в виду, что данные по малоугловому рентгеновскому рассеянию позволяют однозначно определить лишь некоторые параметры, такие как радиус вращения, максимальные размеры и объем частиц. О форме частиц можно судить лишь косвенно, путем сопоставления экспериментальных данных с расчетными для разных более или менее разумных моделей. Рис. Модели четвертичной сруктуры минимальной а и полной б РНКполимеразы Е. Наилучшие модели РНКполимеразы и ее компонент представлены на рис. При построении этих моделей авторы исходили из предположения, что в процессе соединения субкомпоненты РНКполимеразы не меняют своей структуры. Знакомство с литературой по структуре РНКполимеразы на наш взгляд показывает, что серьезная работа в этом направлении только начинается. Очень важную роль сыграло определение полной аминокислотной последовательности РНКполимеразы . Ее знание позволяет в частности постепенно накапливать сведения о том, какие участки полипептидных цепей субъединиц располагаются на поверхности молекулы РНКполимеразы и могут следовательно формировать каталитические центры РНКполимеразы и участвовать в контактах с различными лигандами см. Есть основания полагать, что в ближайшее время удастся наладить идентификацию продуктов расщепления субъединиц, что должно существенно обогатить информацию, получаемую в опытах по аффинному мечению РНКполимеразы. Хочется надеяться, что будут преодолены хронические трудности, возникающие при электронномикроскопическом исследовании РНКполимеразы.