Регуляция транскрипции гена гемолизина II Bacillus cereus

• Автор: Родикова, Екатерина Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 112 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .В. как объект для изучения гемолизинов

1.2. Гемолизины i и их гены

1.2.1. Сфингомиелиназа и церсолизин

1.2.2. Церсолизин гемолизин 1

1.2.3. Гемолизин

1.2.4. Гемолизин III

1.2.5. Цитотоксил К

1.2.6. Гемолизин II

1.3. Регуляторы продукции гемолизинов В.
1.3.1. Плсйогропный регулятор
1.3.2. Регулятор гомеостаза железа
1.3.3. Рег улятор экспрессии гемолизина В. I
1.4. семейство транскрипционных регуляторов
1.4. 1. Регулятор
1.4.2. Регулятор
1.4.3. Регулятор
1.4.4. Репрсссор СргВ
1.4.5. Белок
1.4.6. Белок
1.4.7. регулятор превращения холима в глициибстаин в . i
1.4.8. Регуляюр АгрА
1.4.9. Белок регулирует гены факторов вирулентности
в Vii i .
I лава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы и реактивы
2.1.1. Штаммы бактерий и плазм иди ыс вектора
2.1.2. Среды и основные буферы
2.1.3. Материалы и реактивы
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение тотальной ДК из микроорганизмов рода i
2.2.2. Выделение тотальной РНК.
2.2.3. Выделение плазмидиой ДИК
2.2.4. Препаративное выделение фрагмента ДИК
2.2.5. Получение компетентных клеток .i и их трансформация
2.2.6. Анализ рекомбинантных клопов
2.2.7. ПЦРамiишфикация ДНК
2.2.8. Проведение реакций модификации ДНК
2.2.9. Плазмидныс конструкции
2.2 Определение и анализ первичной последовательности Д1I
2.2 Электрофорез в полиакриламидном и агарозном гелях
2.2 Реакция удлинения праймера
2.2 Экспрессия и очистка белков
2.21. Экспрессия и очистка рекомбинантного белка Гиг
2.22. Экспрессия и очистка РИКполимеразы
2.23. Экспрессия и очистка III
2.2 Взаимодействие белков с Д1I
2.2 Взаимодействие IIгюлимеразы с III
2.2 Защита ДНК от расщепления ДНказой 1
2.2 Определение транскрипционной активности промоторов
2.2 Перманганатный футнринтинг
2.2 Спектры кругового дихроизма
2.2 Измерения флуоресценции анизотропии Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Структура регуляторной области гена гемолизина
3.2. Анализ выведенной аминокислотной последовательности I
3.3. I негативно регулирует транскрипции гена гемолизина II
3.4. Взаимодействие I с оператором гена гемолизина II
3.5. Нромогорнооператорный район гена I
3.6. негативно регулирует транскрипцию гена гемолизина II i vi
3.6.1. Получение рекомбинантного белка 6i
3.6.2. Взаимодействие с промоторнооператорной область гена гемолизина II
3.6.3. Влияние на экспрессию гена гемолизина II ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Бактерии этой группы широко распространены в природе и имеют ярко выраженное филогенетическое родство, морфологическое и физнологобиохимичсскос сходство на фоне широкого диапазона их патогенных свойств. В. сегеия, занимая но патогенному статусу промежуточное положение среди представителей данной группы бацилл и продуцируя широкий спектр гемолизинов, может служить удобной моделью для изучения этих токсинов. Еще одной причиной, которая побуждает к активному изучению регуляции экспрессии токсинов, вырабатываемых В. НлНиппежгу и В. Нгаси, является огромная значимость этих микроорганизмов для человека. В. ссгет один из основных бактериальных загрязнителей производимых промышленностью продуктов питания, лекарственных и косметических препаратов. Вл В. i печально известен как опасный патоген, вызывающий сибирскую язву. Поэтому изучение регуляции отдельных токсинов, продуцируемых данными бактериями, для определения степени их безопасности для животных и человека является актуальной задачей. Хорошо известно, что В. , ii, . Гемолизин И принадлежит к семейству рскладчагых пороформирующих токсинов РГТ, имеет высокую степень гомологии ,2 идентичности с а токсином и вносит значительный вклад в суммарную гемолитическую активность штаммов В. В. iii. Несмотря на то, что гемолитические токсины В. Подробно описан лишь один илейотропиый регулятор, , который является активатором генов фосфолипаз, негемолитического и гемолитического энтеротоксииов, а также некоторых других генов В. В. iii . i, , Ivv . Ныло показано влияние еще одного 1ена,у7АА, на продукцию фосфолипаз, гемолизина и ряда других внеклеточных факторов вирулентности у штаммов В. В. iii ii . Но в данном случае это влияние сводится к регуляции экспорта белков из клетки, а не затрагивает их синтез. Сравнительно недавно был описан еще один илейотропиый транскрипционный регулятор i , регулирующий как процессы усвоения и накопления железа бактериальной клеткой, так и биосинтез некоторых факторов патогенности ivi . Между тем вопрос о регуляции экспрессии генов токсинов неразрывно связан с вопросом регуляции патогенных свойств и весьма актуален. Цели и задачи исследования. Цслыо настоящей работы являлось исследование регуляции транскрипции гена гемолизина II В. в транскрипции гена . Г. К. Скрябина РАИ. Научная новизна работы. Впервые получены данные о регуляции экспрессии потенциального фактора патогенности В. II. Показано, что в промоториоомераторной области гена расположено два опера горных участка сайты связывания двух регуляторных белков I и . Продемонстрировано, что белок I негативно регулирует транскрипцию гена гемолизина II В. Установлено, что в нромоторнооператорной области гена расположено три потенциальных перекрывающихся сайта связывания I, с которыми одновременно взаимодействует только два димера регуляторного белка. Показано, что в отличие ог ряда ДПКсвязывающих белков I не способен вносить значительных конформационнмх изменений в ДИК сайта мишени. Показано негативное влияние на транскрипцию гена гемолизина II В. . Практическое значение работы. Исследование регуляции экспрессии бактериальных токсинов не только представляет несомненный научный интерес, по и важно в практическом плане, как создание основы для осуществления направленною контроля процесса патогенеза. Знания о регуляции экспрессии генов, кодирующих токсины, может быть использовано при создании принципиально новых терапевтических и профилактических подходов, а также новых лекарственных препаратов, что позволит отказаться от традиционной терапии антибиотиками. Полученные данные но исследованию молекулярных механизмов регуляции экспрессии генов гемолизинов В. В. ашкгайх, как наиболее близкого к В. Кроме тою, данные исследования важны и для сельского хозяйства, в котором применяется ряд микроорганизмов, содержащих потенциальные факторы патогенности В. Миппетк.