Биологически активные искусственные белки на основе альбебетина и функциональных фрагментов α-интерферона, фактора дифференцировки HLDF и инсулина

• Автор: Черткова, Рита Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ДИЗАЙНА БЕЛКОВ У О С ЗАДАННОЙ СТРУКТУРОЙ.

1.1 аСпирльнме белки .

1.2 Белки со смешанной а0 структурой.

1.3 Клруктурмые белки .

Глава 2. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ДИЗАЙНА ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

2.1 Дизайн каталигичоской активности. v.

2.2 Конструирование мембранных белков и ионных каналов.

2.3 Дизайн лигандсвязывающего участка белковой молекулы.

2.4 Альбеферон биологически активный искусственный белок

Глава 3. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ФРАГМЕНТЫ ИНТЕРФЕРОНАа, ФАКТОРА ДИФФЕРЕЦИРОВКИ I1 И ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
3.1 Интерфероныа и их функциональные пептиды
3.2 Фактор дифференцирован I. и ею биологически активные фрагменты
3.3 Инсулин и инсулинподобные полипептиды.
ЧАСТЬ II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
4.1 Материалы ММММ1ММ1ММ1ИИ1тИ1Ы1ММ1ИНИИИитиНИ.НП1ИМММИимп.мм1мм.ма.итииамн.м.и.м
4.1.1. Реактивы и ферментные препараты
4.1.2. Штаммы
4.1.3. Плазмидные вектора
4.1.4. Питательные среды для роста бактерий
4.1.5. Синтетические олигонуклеотиды.
4.2 Мегоды.
4.2.1. Трансформация клеток .i плазмидной ДНК .
4.2.1.1. Приготовление компетентных клеток
4.2 Трансформация плазмидной ДНК
4 Выделение плазмидной ДНК
4.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.
4.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК
4.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля
.6. Определение нуклеотидной последовательности ссквснированис ДНК.
4.2.7. Олигонуклеотидналравленный мутагенез .
4.2.8. Полимеразная цепная реакция ПЦР .
4.2.9. Экспрессия генов рекомбинантных белков
4.2 Анализ локализации гибридных белков в клетках соН
4.2 Выделение и очистка гибридных белков.
4.2 Выделение и очистка целевых искусственных белков.
4.2 Аналитические методы им.и.и.ни.И1ИИ.М.ии.и.И.НИ.Н.и.ИМ.1.ЫИН.Н.1.И.иШ1П.1И.1и1МШ1И1И
1. Электрофоретический анализ белков в ПААГ
.2. Количественный анализ белковых препаратов
3. Определение Дгконцевой последовательности полипептидов.
4.2 Методы структурных исследований .
4 Спектры КД.
4 Спектры НЯМР.
4.2 Методы биологических исследований
4 Культивирование клеточных линий.
4 Определение антипролиферативной активности
4 Определение дифференцирующей активности
4 Определение противовирусной активности.
4 Определение цитотоксичсской активности.
4 Определение мнеулинподобной активности
4.2 Построение молекулярных моделей .
4.2 Исследование иммуногснности искусственных белков.
I лава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
5.1 Дизайн биолоичсски активных вариантов шбебешна.
5.2 Конструирование генов биологически активных вариантов альбебетина.
5.3 Экспрессирующие вектора и биосинтез в прокариотической системе
5.4 Выделение и очистка искусственных белков
5.4.1. Вылелсние и очистка гибридных белков.
5.4.2. Выделение и очистка целевых искусственных белков.
5.5 Структурные свойства биологически активных вариантов альбебегика
5.5.1. КДспекгроскопия искусственных белков
5.5.2. ЯМРслектроскопи искусственных белков.
5.6 Биологические свойства искусственных белков.
5.6.1. Противовирусные и цнготоксичсскис свойства двух вариантов альбеферона. содержащих пептидный фрагмент из консенсусной последовательности ИФНОг
5.6.2. Влияние белка на дифференцировку и рост промиелоцитариой лейкемической линии
клеток человека .
5.6. Влияние вариантов альбсбстина. содержащих инсулинподобный пептидный фрагмент на способность клеточной линии 9 поглощать глюкозу
5.7 Исследование ммуногенности альбсбстина и сто биологически активных вариантов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В качестве носителя может выступать молекула искусственного белка или белка v, не обладающего собственной функциональной активностью. Создание первого белка v 1 явилось началом быстрого развития белковой инженерии искусственных белков нового направления в молекулярной биологии, в котором за последние годы достигнуты значительные успехи обзоры 2, 3. Ранее был впервые получен искусственный белок альбебетин 4, 5, обладающий заданной пространственной структурой две аспирали, лежащие на рлисте, и уникальной, не наблюдающейся в природных белках топологией. На пример альбсбстина была показана принципиальная возможность использования белков в качестве эффективных носителей биологических активных пептидных последовательностей. Так, модельный иску сственный белок атьбеферон 6. ИФНстг человека 8 и, по данным предварительного исследования, низкой иымуногснностью 9. Помимо потенциальной возможности использования в качестве фармакологических средств, подобные конструкции могут служить инструментом для исследования функциональной роли тех или иных непрерывных фрагментов белковых молекул, тем самым способствуя более глубокому пониманию механизмов их действия. Все вышеизложенное определяет актуальность задачи получения и подробного исследования белковых конструкций на основе альбсбстина, содержащих заданные биологические активности и представляющих прикладной биомедицинский или биотехнологический интерес. Цель исследовании. Целью настоящей диссертационной работы являлось конструирование, получение и исследование свойств ряда биологически активных вариантов альбсбстина, содержащих в своем составе функциональные пептидные фрагменты человеческих ИФНа2, фактора дифференпировки и инсулина. Основные задачи исследования. Осуществить теоретический дизайн белковых конструкций, имитирующих функциональный эпитоп ИФНа2 противовирусный центр связывания аинтерферонов воспроизводящих дифференцирующую и инсулинподобную активности фактора дифференцировки и инсулина, соответственно. Получить гены этих белковых конструкций и вектора для экспрессии в прокариотической системе ii i. Разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки искусственных белков. Получить альбсбстнн и его варианты в необходимых для исследований количествах. Исследовать и сопоставить физикохимические свойства полученных белков со свойствами альбебетина. Определить биологическую активность полученных белков. Научная новизна и практическая значимость работы. Бее результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые. Проведен теоретический дизайн вариантов искусственного белка альбсбстина. ИФНа2, фактора дифферегщнровки Н1ЛЭР и инсулина человека. Получены экспрессирующие конструкции, содержащие гены пяти новых искусственных белков. На основе этих конструкций разработана эффективная схема биосинтеза, выделения и очистки, позволяющая нарабатывать искусственные белки в количествах, необходимых для биологических и физикохимических исследований. Проведено сравнительное исследование спектров кругового дихроизма и ядерного магнитного резонанса полученных искусственных белков. Показано, что присоединение пептидных фрагментов к молекуле альбсбстина не приводит к значительным изменениям вторичной и третичной структуры белка, хотя вызывает небольшое увеличение содержания неупорядоченной структуры и лабильности третичной структуры. Исследованы биологические свойства искусственных белков. Показано, что оба варианта альбсбстина, содержащие пептидные фрагменты ИФНаь обладают противовирусной активностью, причем один из них практически воспроизводит активность рекомбинантного ИФНа2 альбсбстин, содержащий фрагмент из фактора дифференцировки НЫЖ обладает дифференцирующей и антипролиферативной активностью, сопоставимой с активностью исходного пептида альбсбстин, содержащий инсулинггодобный пегттил, воспроизводит активность последнего приблизительно на . Наличие биологической активности полученных искусственных белков является основой для их дальнейшего изучения в качестве возможных лекарственных препаратов нового поколения.