Экспрессия генов белков NS5B и NS5A вируса гепатита C, ингибиторный анализ и белок-белковое взаимодействие

• Автор: Иванов, Александр Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 145 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2.1. СТРУКТУРА ГЕНОМА ВГС.

2.2. БЕЛКИ ВГС.

2.2.1. БЕЛОК К АПСИДА

2.2.2. ГЛИКОПРОТЕИНЫ ОБОЛОЧКИ Е1 И Е

2.2.3. БЕЛОК Р

2.2.4. БЕЛКИ 2, 3 И 4.

2.2.5. БЕЛОК

2.2.6. БЕЛОК 5А

2.2.7. РНКЗАВИСИМАЯ РНКПОЛИМЕРАЗА 5.

2.2.7.1. Структура белка.

Биохимические свойства РРНКП.
Синтез вирусной РНК v.
2.2.7.4. Состав и функционирование репликационного комплекса ВГС. Белокбелковые взаимодействия
2.2.7.5. Ингибиторы РРНКП ВГС.
2.3. ЖИЗНЕННЫЙ ЦИКЛ ВГС
2.3.1. ПРОНИКНОВЕНИЕ ВИРУСНЫХ ЧАСТИЦ В КЛЕТКУ
2.3.2. РЕПЛИКАЦИЯ ВГС
2.3.3. ТРАНСЛЯЦИЯ РНК ВГС
2.3.4. ПРОТЕОЛИТИЧЕССИЙ ПРОЦЕССИНГ И СБОРКА ВИРУСНОЙ ЧАСТИЦЫ
2.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Приготовление и трансформация компетентных клеток . i
3.2. Трансформация бактериальных клеток.
3.3. Манипуляции с плазмидной ДНК.
3.4. Полимеразная цепная реакция
3.5. Конструирование плазмид
3.6. Экспрессия и выделение 5 белка
3.7. Экспрессия и выделение белка
3.8. Экспрессия и выделение казеинкиназ I и II
3.9. Моделирование вторичной структуры мРНК.
3 Выделение РНК и гибридизация.
3 Препаративное получение I РНКматрицы для определения активности РРНКП v
3 Определение активности РНКзависимой РНКполимеразы.
3 Исследование модифицированных ди и тригидроксибензолов как ингибиторов активности РРНКП.
3 Компьютерное прогнозирование сайтов фосфорилирования казеинкиназами 1 и II.
3 Фосфорилироваиие белков казеинкиназами I и II.
3 Получение лизата культуры гепатоцитов человека 7.
3 Получение и частичная очистка лизата печени кролика.
3 Протеолиз меченого белка 5 в ПААГ
3 Протеолиз меченого 5 белка в растворе
3 Анализ продуктов протеолиза 5 белка
3 Оценка влияния степени фосфорилирования белка 5 на активность РРНКП
3 Определение РНКсвязывающей активности белка 5.
3.Определение термодинамических параметров взаимодействия белков 5 и
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Конструирование системы для эффективной экспрессии белков 5 и 5
3.2. Изучение физикохимических свойств РРНКП ВГС, оптимизация условий определения РНКполимеразной активности и изучение ингибиторных свойств
производных тригидроксибензола пирогаллола
Фосфорилироваиие белка 5 i vi и оценка влияния степени фосфорилирования белка на его способность ингибировать РРНКП ВГС.
4. ВЫВОДЫ.
5. ЛИТЕРАТУРА.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ


РНК вируса содержит одну рамку считывания, ограниченную 5 и Знетранслируемыми участками . Нуклеотидная последовательность 5 высоко консервативна, и ее длина составляет 1 нуклеотид 5. Компьютерное моделирование структуры и последующее биохимическое картирование показали, что вторичная структура 5 состоит из четырех основных доменов и псевдоузла Рис. А 6. Главной особенностью данного участка РНК является наличие внутреннего сайта посадки рибосомы I, обеспечивающего трансляцию генома ВГС по кэпнезависимому механизму 7. Рис. Вторичная структура 5 А и 3 В нетранслируемых участков В. Структуру З можно разделить на 3 участка короткий вариабельный участок около нуклеотидов, полиипол и пиримидинпоследовательность и высококонсервативный участок, получивший название ХРНК нуклеотидов, рис 2Б 8. По данным компьютерного моделирования, подтвержденного химическим и ферментативным картированием, ХРНК состоит из трех шпилек. Роль З состоит в связывании вирусной РНКзависимой РНКполимеразы и обеспечении инициации репликации вирусного генома 9, . Хотя i vi синтез новой цепи по беспраймерному v механизму может начинаться не только с ХРНК, но и с полиполипирим и динового участка 9, РНК ВГС сохраняет инфекционность только при наличии полноразмерного З . Таблица 1. ВГС отличается значительной генетической вариабельностью. В настоящее время выделяют шесть генотипов ВГС, каждый из которых подразделяется на большое число субтипов, обозначаемых строчными буквами 1а, 1Ь и т. Геномы типов различаются на по аминокислотной последовательности, а субтипы на . Существует достаточно четкое географическое распределение генотипов ВГС, причем в России преимущественное распространение имеет вирус типа 1Ь см. В Г С, геном которых в 5концевой области характерен для генотипа 2к, а в Зконцевойдля генотипа 1Ь напр. Белковый состав ВГС представлен на рис. Б. Все вирусные белки образуются в результате трансляции с единственной рамки считывания и постраисляционного процессинга полипротеина см. Полипротеин кодирует белков, которые располагаются в следующей последовательности СЕ1Е2р7ЫБ2МБЗЫАМВИАЫВ Табл. Таким образом, структурные белки сосредоточены в Ыконцевой части полипротеина, а неструктурные ферменты и регуляторные белки в его Скоицевой части. Кроме того, недавно был описан одиннадцатый белок ВГС с молекулярной массой кДа. Таблица 2. ЫБ4В Трансмембранный белок. А Регуляторный белок определяет вирусный ответ на терапию интерфероном а, отрицательный регулятор полимеразной активности белка ЫВ, нарушение многих путей передачи сигнала в клетке. Хотя образовани белка отмечено не только в лабораторных условиях, но и у ВГСинфицированных пациентов, роль его в настоящее время неясна. Ниже в данном обзоре будут рассмотрены основные данные об этих белках. Кроме того, особое внимание будет уделено неструктурным белкам 5 и 5, а также низкомолекулярным ингибиторам последнего. БЕЛОК КАПСИДА Структурный белок С i является основным компонентом вирусного капсида, что подразумевает наличие у него способности к олигомеризации и к связыванию РНК ВГС. В работе при экспрессии Сбелка в . В аналогичные вирусоподобные частицы, полученные в бакуловирусной системе экспрессии, может включаться полноразмерная РНК ВГС или ее фрагменты, но не чужеродная РНК . Образование подобных нуклеопротеидных комплексов основано на способности Сбелка связываться с определенными фрагментами 5 вирусной РНК . В клетках Сбелок связан с эндоплазматического ретикулума ЭР со стороны цитоплазмы 4. Сходную локализацию имеют и ряд других белков вируса, что предполагает их возможное взаимодействие друг с другом. Так, к настоящему времени имеются данные о связывании Сбелка с гликопротеином Е1 и 5 , а также с неструктурным белком 5 с активацией расщепления последнего каспазами см. Сбелок способен также к взаимодействию с рядом белков клеткихозяина. Например, его связывание с белками, содержащими мотивы, характерные для x РНКхеликаз X3, X, , может приводить к нарушению метаболизма РНК и представлять собой механизм ингибирования трансляции клеточных мРНК .