Неканонические субстраты и матрицы в реакциях, катализируемых РНК-полимеразой бактериофага Т7 и обратной транскриптазой ВИЧ-1

• Автор: Андреева, Ольга Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

Оглавление.

Список сокращений.

Введение.
I. ДНК и РНКнолимсразы струюурнофункниоиалыюс разнообразие и единый каталитический механизм литературный обзор.

1.1. Пространственная структура односубъсдиничных нуклсотидполимсраз.

1.2. Структура активного центра и связывание субстратов.

1.2.1. Структурные мотивы.

1.2.2. Связывание матрицыпраймера.

1.2.3. Связывание нуклсозидтрифосфатов.

1.3. Катализ полимеразной реакции.

1.3.1. Ионы металла в активном центре полимеразы.

1.3.2. Конформационные изменения полимераз при связывании
субстратов.
1.3.3. Процсссивность полимераз.
II. Материалы н методы.
.1. Материалы.
.1.1. Ферменты.
.1.2. Реактивы.
.1.2.уклсознды, нуклеотиды и их производные.
II. 1.4. Среды для культивирования клеток Е.со.
.1.5. Плазмиды, использованные в работе.
.2. Методы.
П.2.1. Выделение и очистка Т7 РНКП и сб мутантной формы
9, 17 РНКП.
.2.2. Выделение обратной транскритазы ВИЧ1 и ее мутантных форм.
.2.3. Электрофорез белков.
.2.4. Препаративное выделение илазмидной ДНК.
П.2.5. Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции.
.2.6. Транскрипция i vi. Получение смешанных полинуклеотидов.
П.2.7. Электрофорез образцов нуклеиновых кислот в ПЛЛГ.
.2.8. Электрофорез образцов в агарозном геле. Элюция из геля.
П.2.9. Определение эффективности полимеразной реакции.
.2 РНКЛНКполимеразная реакция, катализируемая формы
9, 17 РНКП.
.2 Реакция обратной транскрипции.
П.2 Получение Рмсчсных ДНК и олигонуклеотидов.
.2 Секвенироваиис РНК и СПИ.
.2 Получение активированной ДНК.
.2 Определение констант ингибирования аналогами пнрофосфата
и нуклеотидов.
.2 Включение модифицированных в РНКнродукт реакции
РНКП.
.3. Построение пространственных моделей.
.3.1. Моделирование связывания модифицированных праймеров в активном центре ОТ.
.3.2. Моделирование связывания аналогов в активном центре Т7 РНКП.
III. Неканонические субстраты н матрицы в реакциях, катализируемых РНКполимеразой бактериофага Т7 и обратной транскиптазой ВИЧ1.
обсуждение результатов
III. 1. Синтез смешанных рибодезоксирибополинуклсотидов мутантной формой Т7 РЖП.
1.2. Смешанные полинуклеотиды в качестве матриц для ОТ ВИЧ1.
1.3. Исследование взаимодействия ОТ ВИЧ1 с модифицированными праймерами, содержащими 20Р0рнбофуранозиладснозин.
1.4. Взаимодействие ОТ ВИЧ1 и Т7 РНКП с фосфонатиыми аналогами
и неорганического пирофосфата.
IV. Выводы.
Список литературы


Отдельной частью работы являлось исследование специфичности Т7 РНКП и ОТ в отношении нуклсозндтрифосфатов, содержащих модификации трифосфатнон части молекулы. I. Литературный обзор. РАЗНООБРАЗИЕ И ЕДИНЫЙ КАТАЛИТИЧЕСКИЙ МЕХАНИЗМ. Среди процессов, протекающих в клетке, важнейшими являются воспроизведение и передача генетической информации от родителей потомству. Для этого все живые организмы кодируют ряд ферментов нуклеотидполимераз, осуществляющих репликативные, репаративные и транскрипционные функции. На первый взгляд, между этими ферментами мало общего к ним относятся и односубьсднннчиая рспарнрующая ДНКполимераза р эукариотической клетки с молекулярной массой кДа 1, и огромные мультисубьсдииичиыс полимеразы, например, ДНКполимераза 1 . Да . Среднюю ступень сложности занимают такие полимеразы, как ДНКполимераза I . ЛОЛИПС1ГТИД1ЮЙ цепыо 3. В настоящем обзоре речь будет идти в первую очередь об односубьединичных полимеразах. Именно эти ферменты, относительно простые по строению, и, в то же время, обладающие всей функциональной полнотой, способны в настоящее время дать наиболее полную информацию о тонких механизмах их действия. Успехи последних лет, связанные, в первую очередь, с исследованиями трехмерных структур этих ферментов, позволяют, сформулировать общие черты функционирования нуклеотидполимераз. Несмотря на значительное разнообразие в семействе нуклеотидполимераз, при ближайшем рассмотрении оказывается, что все они являются вариациями на одну тему. ЫТР или гЫТР 4. Изучение точности полимеризации, важного атрибута ферментов этого типа, позволяет предположить, гго многие хотя и не все механизмы дискриминации между правильными и неправильными парами оснований сохраняются во всем семействе полимераз 5. Вероятно, наиболее важный аргумент в пользу схожести механизма всех полимераз вытекает из анализа их белковых последовательностей. Хотя существует лишь небольшое сходство последовательностей отдаленно родственных полимераз, оказывается, что несколько критических остатков их активного центра консервативны. Такого рода гомологии среди ДНК, РНК полимераз и обратных тралскрнитаз предполагают существование общего механизма переноса фосфата, необходимого для синтеза мсжиуклсотидной связи 6. Однако эти ферменты обладают и рядом различий способностью дискриминации между рибо и дсзокснрибосубстратами, специфичностью в отношении типа матрицы так, обратная транскрнптаза ОТ способна использовать в качестве последней как РНК, так и ДНК 4 и характером бслокнуклсинового взаимодействия характера бслокнуклсинового взаимодействия РПКполимеразы узнают специфическую нуклеотидную последовательность промотора, ДНКполнмеразы относительно неспецифично связываются с 3 концом ДНКпранмера, комплементарно взаимодействующего с ДНКматрицей. Очевидно, что эти отличия обусловлены тем, что разные полимеразы участвуют в различных молекулярногенетических клеточных процессах репликация, транскрипция, обратная транскрипция, репарация. Как следствие, от них требуется работа с различными типами матриц, с отличающейся процсссивпостью, точностью и скоростью, в разных условиях и в различном окружении. Так, полимеразы, участвующие в репарации, часто обладают 53 экзонуклсазной активностью 4 и эндоиуклеазной активностью по отношению к одно цепочечным 5хвостам 7. Большое число ДНКполимераз, от которых требуется высокая точность копирования в первую очередь репликационные, обладают корректирующей 35 экзонуклсазной активностью, ассоциированной либо с отдельным доменом ДНКполимераза I . , либо с отдельной субъединицей ссубъсднннца ДНКполимеразы III . Обратные транскриптазы часто содержат домен с активностью РНКазы Н, отвечающей за удаление РНК из РНКДНК гибрида при синтезе второй цепи ДНК 9. Эти домены, как правило, не имеют структурного сходства друг с другом 2,. Пространственная структура односубъелиничнмх нуклеотид полимераз. Все нуклеотидполимеразы в зависимости от используемых ими матриц ДНК или РНК и нуклсозидтрнфосфатов или были разделены на четыре основные семейства ДНКзависимыс ДНКполимеразы ДДНКП ЕС 2.