Изучение взаимодействия р50-мажорного белка мРНП - с РНК

• Автор: Скабкин, Максим Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Пущино-на-Оке
• Количество страниц: 133 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МАЖОРНЫЕ БЕЛКИ ЯДЕРНЫХ И ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИХ мРНП

СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ

I. Гетерогенные ядерные рибонуклеопротендные частицы гяРНП.

1. История открытия гяРНП.

2. Белки гяРНП

2.1. Общие характеристики белков гяРНП

2.2. Домены белков гяРНП.

2.2.1. РНКсвязывающий домен .

2.2.2. КНдомен

2.2.3. Вспомогательные домены xii i
2.3. Коровые белки гяРНП.
2.3.1. АВ группа белков гяРНП.
2.3.2. Группа С белков гяРНП.
2.4. Прочие не коровые белки гяРНП.
3. Упаковка гяРНК и структура гяРНП
4. Транспорт мРНК из ядра в цитоплазму.
II Цитоплазматические матричные
рибонуклеопротендные частицы мРНП
1. История открытия цитоплазматических мРНП
2. Основные характеристики мРНП
3. Мажорные белки цитоплазматических мРНП
3.1. ПолиАсвязывающий белок РАВР
3.1.1. Структура РАВР и его связывание с мРНК
3.1.2. Функции РАВР
3.2. Мажорный белок цитоплазматических мРНП р
и его гомологи с доменами холодового шока белки
3.2.1. Обнаружение р и других членов семейства
белков с доменами холодового шока
3.2.2. Строение р
3.2.3. Структура генов р и его гомологов у позвоночных.
3.2.4. Взаимодействие р с РНК
3.2.5. р в биогенезе и функционировании мРНК.
3.2.6. Изменение концентрации р в клетке и ее компартментах
4. Структурная организация цитоплазматических мРНП.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Выделение рекомбинантного р из ii i
2. Получение фрагментов р
3. Выделение плазмидной ДНК из ii i
4. Рестрикция плазмиды.
5. Аналитический электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы
6. Получение транскриптов РНК i vi.
7. Электрофорез РНК в полиакриламидном геле в присутствии мочевины.
8. Препаративное выделение РНК из полиакриламидного геля.
9. Проведение полимеразной цепной реакции ПЦР
. Мечение ДНК Р по 5 концу
. Электрофорез белков в полиакриламидном геле в присутствии
. Сборка комплексов мРНК с р и их анализ
центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы
. Центрифугирование комплексов мРНКс р
в градиенте плотности
. Определение четвертичной структуры р
в комплексе с мРНК методом сшивки глутаровым альдегидом.
. Исследование взаимодействия белка с РНК
методом замедления подвижности РНК в геле i .
. Определение относительных контактов доменов р с мРНК
методом ультрафиолетовых сшивок белка с 2Рмеченной РНК
. Исследование распределения белка р
во фракциях градиента методом
. Отжиг комплементарных цепей
нуклеиновых кислот в присутствии р
. Исследование обмена комплементарных цепей
РНК в присутствии р и его фрагментов
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Исследование комплексов р с мРНК.
1.1. Седиментационная характеристика комплексов р с мРНК
1.2. Плотностное распределение комплексов р с мРНК в градиенте .
1.3. Комплексы р с мРНК нестабильны, и белок
легко переходит с одной молекулы мРНК на другую.
1.4. При низких соотношениях рмРНК белок связывается с мРНК как мономер, в то время как при высоких
соотношениях р образует на мРНК мультимеры
1.5. При низких соотношениях рмРНК белок связывается с мРНК двумя РНКсвязывающими доменами, в то время как при высоких значениях этого соотношения белок взаимодействует с мРНК преимущественно концевой
частью молекулы с доменом холодового шока.
2. Влияние р на вторичную структуру РНК.
2.1. р ускоряет отжиг взаимокомплементарных цепей РНК.
2.2. р ускоряет обмен комплементарных цепей в молекулах
РНК и приводит к образованию наиболее протяженных дуплексов.
2.3. р вызывает плавление или, наоборот, отжиг
РНК в зависимости от соотношения рРНК
2.4. р ускоряет отжиг комплементарных цепей ДНК.
2.5. Фосфорилирование i vi белка р казеинкиназой И снижает
его ДНКотжигающую активность, но не влияет на отжиг РНК
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
1. р основной структурообразующий белок
цитоплазматических мРНП эукариотических клеток.
2. р шаперон нуклеиновых кислот
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Обычно белки гяРНП содержат одну или несколько копий так называемого РНКсвязывающего домена ii i, а в некоторых случаях КНдомена К i, обычно располагающихся в концевой части молекулы белка и отвечающих за связывание с РНК. Помимо этих основных доменов в молекулах белков гяРНП могут присутствовать вспомогательные домены. Вспомогательные домены иногда также обладают сродством к РНК, но, прежде всего, они участвуют в белокбелковых взаимодействиях. В качестве вспомогательных доменов в белках гяРНП чаще всего обнаруживается глицинбогатый домен домен . Следует заметить, что подобная модульная структурная организация характерна не только для белков гяРНП, но и вообще для РНКсвязывающих белков , ii , . Таблица 1. А1В2 9. РНК экспорт мРНК биогенез теломер упаковка мРНК i, I . I 8,,8 2х да сплайсинг мРНК локализация мРНК упаковка мРНК i, . I2 5. РНК стабилизация мРНК упаковка мРНК i . РНК рекомбинация биогенез теломер транскрипция ii . Б1Е2 РСВР 7. Зх да стабилизация мРНК трансляция ii . Зх нет данных сплайсинг мРНК i . НН 6. Зх нет данных сплайсинг мРНК полиадснилирование . РНК полиаденилирование трансляция . Зх КН да транскрипция трансляция биогенез теломер ii . РНК стабилизация мРНК i . М 7,,2 Зх 3 нет данных сплайсинг мРНК ответ на тепловой шок i . РНК онкогенез . I2 по 7,4 Зх нет данных сплайсинг мРНК . Зх нет данных обнаруживается при аутоиммуных реакциях . Этот домен обнаружен у нескольких сотен белков, взаимодействующих с РНК. Он состоит из 0 аминокислотных остатков а. Характерной чертой , по которой его легко выявляют в различных белках, является присутствие двух консенсусных последовательностей из 8 и 6 аминокислотных остатков, названных РНП1 VX и РНП2 V, соответственно . Как можно видеть, эти консенсусные последовательности богаты ароматическими аминокислотами. Наличие в какомлибо белке этих двух мотивов или хотя бы консенсуса РНП1 позволяет с большой вероятностью утверждать, что белок содержит и может связываться с РНК . Пространственная структура была определена методом рентгеноструктурного анализа РСА i . ЯМР . Зтяжи примыкают друг к другу и располагаются в центре листа. Исследование комплексов с РНК методом ЯМР . РСА i . РНПконсенсусах, в неспецифическом связывании с РНК. Боковые группы этих остатков вступают в стэкинг взаимодействие с основаниями РНК, а кроме того, некоторые аминокислотные остатки консенсусной последовательности образуют с РНК водородные связи. Помимо аминокислотных остатков, находящихся в тяжах, во взаимодействии с РНК активно участвуют также остатки, расположенные в петлях, соединяющих отдельные тяжи, и прежде всего, в 3ей петле между 2 и рЗтяжами , , , а также остатки на Сконце , . Предполагается, что именно эти участки сообщают доменам у различных белков специфичность по отношению к РНК i Vi, . Аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии с РНК, образуют достаточно плоскую поверхность, связавшись с которой, РНК остается легко доступной для взаимодействия с другими РНК и белками. Это особенно важно для мультикомпонентных комплексов, участвующих в процессинге гяРНК , ii , . За последние несколько лет появились интересные данные, свидетельствующие о значительных конформационных перестройках как в РНК, так и в некоторых участках , при их взаимодействии, а также в участках белка, расположенных за пределами i Vi, , . При связывании с РНК белков с несколькими копиями , происходит существенное изменение конформации промежуточных участков белка, соединяющих . Например, достаточно неструктурированный линкер, соединяющий два в нуклеолине белке, участвующем в процессинге рибосомальной РНК или в x белке, участвующем в сплайсинге гяРНК, при связывании с соответствующей РНК переходит в упорядоченную спиральную конформацию . Подобные переходы из свободной, подвижной конформации в жесткую, упорядоченную при связывании с РНК также наблюдаются в петлях, соединяющих различные тяжи в i . Путем изменения структуры линкерного участка отдельные могут влиять друг на друга и принимать согласованную конформацию, необходимую для эффективного функционирования.