Разработка систем идентификации фитопатогенов различных таксономических групп методом FLASH-PCR

• Автор: Рязанцев, Дмитрий Юрьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 149 с. : ил.

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение. Обзор методов диагностики фитопатогеноп.

Иммунохимическис методы

Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот

Микрочипы i.

ДНК маркеры

Выбора локуса для видовой дифференциации марксрами

Методы диагностики, основанные на амплификации нуклеиновых кислот

Полимеразная цепная реакция ПЦР
Альтернативные методы амплификации нуклеиновых кислот
Методы с флуоресцентной детекцией результатов амплификации.
Различные подходы к флуоресцентной детекции результатов ПЦР
Методы с флуорссцситой детекцией результатов после амплификации
Флуоресцентная детекция результатов в других системах амплификации.
Краткая характеристика фитопатогеиов.
Ш ТЕР И АЛЫ И МЕТОДЫ
Реактивы, оборудование и штаммы микроорганизмов
Выделение нуклеиновых кислот и реакция обратной транскрипции.
Выравнивание нуклеотидных последовательностей, дизайн праймеров и зондов.
1 Толимерззная цепная реакция в формате
Обшая стратегия подбора праймеров
Детекция результатов ПЦР.
Клонирование положительных контролен.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Стратегия диагностики
Выбор типа флуоресцентномеченого зонда для 1ГЦР в формате .
Адап тация наборов для выделения нуклеиновых кислот
Разработка марксров и диагностических тестсистем для видовой дифференцировки
фитопатогеиов
Выбор участка генома, подбор праймеров.
Подбор и апробация зондов, проверка ингибирования ПЦР амплификацией ВК
Сравнение существующих диагностических систем с разработанными.
Апробация тестсистем на половых образцах
ЛИТЕРАТУРА


Эти подходы имеют и свои недостатки помимо высокой стоимости получения таких антител, к недостаткам можно отнести их строгую специфичность, которая может приводить к ложноотрицательным результатам. Необходимо проводить тщательный анализ специфичности каждой линии моноклональных антител. Следует отметить, что с помощью моноклональных и рекомбинантных антител наиболее успешно удается диагностировать вирусы и бактерии, тогда как в случае более сложных организмов грибов и нематод получение специфических антител значительно сложнее. Коммерческие моноклональные и поликлональные антитела для детекции фитопатогенных вирусов и бактерий производятся несколькими компаниями i США, Асеп Британия и гi Италия. ИФА. Преимуществом данного метода является высокая производительность, так как он выполняется на луночных планшетах. Существует три модификации метода. Прямой вариант, когда антиген адсорбируют на плашках, промывают и добавляют коныогат комплекс иммуноглобулинов с ферментом, а затем субстрат, который после реакции под действием фермента дает цветное окрашивание. Метод двойных антител, когда плашки с адсорбированным антигеном вначале инкубируют с антителами, а затем с коньюгатом и субстратом. Наибольшее распространение получил сэндвичметод вариант ИФА, при котором лунки сенсибилизируют специфичными иммуноглобулинами, затем проводят отмывку плашек от избытка антител, добавляют раствор антигена и инкубируют, несвязанный антиген удаляют промыванием лунок, на заключительной стадии в лунки вносят коныогат и субстрат, результаты учитывают спектрофотометрпчески , . , , . iI позволяет достигать большей чувствительности. Комбинация ИФА с предварительным этапом обогащения бактериальной культуры на определенной среде и в определенных условиях позволяет детектировать латентную бактериальную инфекцию . Иммунострипы. В настоящее время распространен и более простой метод, основанный на применении иммунохроматографичсского метода иммунострипы мембраны, на которых в различных зонах сорбированы конъюгат, специфические антитела и положительный контроль. После внесения пробы на иммуносгрип, иммобилизованный конъюгат связывается с антигеном, присутствующем в исследуемом материале, формируя при этом комплекс антигенантитело. Полученный иммунный комплекс мигрирует по капиллярам мембраны и после взаимодействия с антителами фиксируется с появлением горизонтальной окрашенной полосы. Данный метод имеет меньшую чувствительность и специфичность, но подходит для полевой экспрессдиагностики. Этот метод применяется для детекции вирусов и бактерий. Коммерческие иммунострипы дя детекции ряда фитопатогенов выпускает фирма i . ИФ. Иммунофлюорссцентный анализ применяют для выявления как антигенов, так и антител. Этот метод основан на использовании реагентов, меченных флюоресцентным красителем. Меченые антитела связываются с антигеном, образуя комплексы, которые можно выявить с помощью флюоресцентной микроскопии. Существуют три модификации иммунофлюоресцентного анализа. Метод прямой иммунофлуорссцснции применяют дя выявления антигенов. Он основан на непосредственном связывании антигена, сорбированного на твердой подложке, с мечеными антителами. Реакцию оценивают с помощью флюоресцентного микроскопа. В основном, этот метод применяется для детекции бактерий . . Перспективной, но пока очень дорогой модификацией является комбинация иммунофлуоресцснтного анализа с проточной цитометрией. Бактериальные клетки идентифицируются по флуоресцентномеченным антителам и детектируются автоматически, используя флуоресцентноактивируемый клеточный сортировщик, который измеряет несколько параметров размер клеток, флуоресцентное изображение клетки, уровень выходного сигнал и фоновый уровень, связанный с мертвыми клетками или дебрисом, основанных на рассеянии света и флуоресценции. Проточная цитометрия может использоваться для рутинной диагностики, например, проверки семян.