Изучение роли негистоновых белков в организации хроматина на границах β-глобинового домена генома Gallus Gallus

• Автор: Истомина, Наталья Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

Оглавление
Оглавление.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура хроматина и транскрипция.

1.1. Регуляция транскрипции на разных уровнях организации хроматина

1.2. Обшая характеристика доменов генома.

1.3. вглобиновый генный кластер кур

1.4. Отличительные черты и Функции гетерохроматина

2. Факторы, определяющие компактизацию хроматина.

2.1. Линкерные гистоны
2.2. Гистоновый кол.
2.3. Негистоновые белки хроматина позвоночных.
3. Генетические элементы на границах активного и неактивного хроматина.
3.1. Инсулятопы. как антагонисты энхансеров.
3.2. Инсуляторы. как барьерные элементы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Реактивы
2. Коммерческие наборы.
3. Антитела
4. Приборы и оборудование.
5. Составы основных растворов
6. Линии клеток
6. Выделение ядер клеток.
8. Генноинженерные методы.
8.1. Полимеразная цепная реакция ПЦР
8.2. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и деЬосЬорилирование
9. Электрофоретические методы
9.1. Электрофорез белков в ПААГ.
9.2. Электрофорез ДНК в агарозном i еле.
. гибридизация.
Формальдсгидная Фиксация и иммунопреципитация хроматина.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИИ
1. Оценка количества белка и белков Г клетках крови на конечных стадиях дифференцировки.
2. Оценка уровня метилирования гистона НЗ в клетках крови на конечных стадиях дифференцировки.
3. Фиксация и иммунопреципитация хроматина клеток крови
3.1. Подбор условий для фиксации и иммуиопреципитацни хроматина при помощи белка .
3.2. Подбор последовательностей ДНК для зондов, использованных в гибридизации.
3.3. Распределение белка вдоль 6глобинового домена .
3.3.1. Распределение белка вдоль глобинового ломена в эритроцитах . .
3.3.2. Распределение белка вдоль глобинового домена в лимфоцитах .
4. Сравнение картины распределения белка с картиной ацетилирования и метилирования гистонов вдоль глобинового домена генома
5. Влияние экспрессии белка в культуре клеток I ЗТЗ на уровень
ацетилирования и метилирования гистонов
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Наиболее изученным нсгистоновым маркером гетерохроматина является гетерохроматиновый белок НР1, способный связываться только с метилированным гистоном НЗ. Ранее в нашей лаборатории был описан еще один белок гетерохроматина от i i ii ii i. Он накапливается в клетках крови птиц на конечных стадиях дифференцировки, связывается с репрессированным хроматином и вызывает его конденсацию. Данная работа была направлена на определение негистоновых белков, участвующих в образовании конденсированного хроматина на границах Во время выполнения данной работы было показано, что уровень всех изоформ белка НР1 в зрелых клетках крови кур незначителен, а значит, данный белок не может являться фактором конденсации хроматина на конечных стадиях дифференцировки. Было показано, что количество белка нарастает в процессе дифференцировки клеток крови, что делает его очевидным кандидатом в факторы, определяющие репрессию хроматина в процессе созревания клеток крови. вдоль 3глоби нового домена совпадает с картиной распределения диметилированного гистона ИЗ и обратно картине распределения ацетилированных гистонов. Целью данной работы было выяснить, участвуют ли негистоновые белки и НР1 в организации хроматина в клетках крови . Оценить наличие вариантов белка II1 в клетках крови . Используя методику иммунопреципитации хроматина, оценить, соответствуют ли последовательности ДНК, взаимодействующие с белком , деконденсироваиному, конденсированному или пограничным участкам хроматина. Исследовать, приводит ли экспрессия белка в культуре клеток I ЗТЗ к изменению уровня ацетилирования и метилирования гистонов. Структура хроматина и транскрипция. Регуляция транскрипции на разных уровнях организации хроматина. Необходимым условием правильного развития и выживания любого живого организма является регуляция экспрессии его генома. До генома отдельной клетки млекопитающих не транскрибируется i . ДНК. Таким образом, ключевым вопросом в биологии многоклеточных эукариот является то, как именно клетка данного типа координирует экпрессию той или иной части своего генома в данный конкретный момент времени. С недавнего времени стало очевидно, что подобная координация обеспечивается не только за счет многочисленных транскрипционных факторов и регуляторных последовательностей ДНК, но и за счет изменений в структуре самого хроматина. Регуляция транскрипции, обеспечивающая переход ДНК из неактивного в активное состояние включает несколько последовательных стадий. Принципиальной характеристикой эукариот, в особенности высших многоклеточных, является то, что ключевую роль в механизмах транскрипционной регуляции играет структура хроматина . Хроматин это плотноупакованный ДНКбелковый комплекс, включающий в себя гистоны и другие ядерные белки, такие как репрессирующие и транскрипционные факторы , . Ряд основных черт хроматина ковалентные модификации цитидина в составе ДНК, ковалентные модификации гистонов, наличие типичных репрессоров и факторов ремоделинга хроматина, определяющих транскрипционную активность генов в его составе отражены в Таблице 1. Изучение структуры политенных хромосом насекомых позволило идентифицировать транскрипционно активные деконденсированныс и неактивные конденсированные участки и картировать положение этих участков в составе хромосом i, , глава . Структурные отличия хроматина не обязательно связаны собственно с транскрипцией, но могут предшествовать ее инициации. Таблица 1. Основные черты хроматина, определяющие его транскрипционный статус Лгпеу и i . Модификации гистонов Г иперацетилирование гистонов НЗН4 диметилирование гистона ИЗ по Ьуз4 метилировнание гистона НЗ по Ьуз фосфорилирование гистона НЗ Г ипоацетилирование гистонов НЗН4. НЗ по 1ув9. Варианты гистонов Вариант НЗ. З и Н2А. Типичные белковые факторы Хроматинремоделирующие факторы, белкиативаторы транскрипции Белок НР 1. Биаг39 Рсв белки, белок НР 1.