Структурно-функциональные основы каталитической активности эндонуклеазы рестрикции Eco29kI

• Автор: Ибряшкина, Елена Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 82 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРЛЩЕИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные понятия о системах рестрикциимодификации Д1I

1.2. Классификация и номенклатура ферментов СРМ

1.3. Системы рестрикциимодификации типа II

их структурнофункциональная организация и биоразнообразие

1.4. Спруктурные особенности эндонуклеаз рестрикции типа II

в эволюционном аспекте

1.5. Механизмы взаимодействия эндонуклеаз типа II с Д1I

1.5.1.роцессы связывания и узнавания ДНК эндонуклеазами типа II
1.5.2. Механизм каталитического расщепления ДНК
эндонуклеазами рестрикции типа II
1.6. Система рестрикциимодификации I и ее основные характеристики
1.7. Анализ структурной организации эндонуклеазы I
2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И МАТЕРИАЛЫ
2.1. Штаммы бактерий, бактериофаги и плазмидные вектора
2.2. Выделение и очистка ДНК
2.3. Клонирование гена эндонуклеазы I6i
2.4. Сайтспсцифичсский мутагенез i vi
2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.6. Получение бактериальной массы
2.7. Экспрессия гена эндонуклеазы I
2.8. Выделение и очистка эндонуклеазы рестрикции 6i
и е мутантных форм до гомогенного состояния в нативных условиях
2.9. Определение ферментативной активности эндонуклеазы
I6i и е мутантных форм
2 Тестирование никазной штриховой активности
мутантных форм эндонуклеазы рестрикции I
2 Ограниченный протеолиз
2 Электрофорез
21. Электрофорез белков в ПААТ
22. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2 КД спектроскопия
2 Анализ специфического узнавания ДНК мутантными формами Есок1
2 Поляризационный флуоресцентный анализ
2 Анализ комплсксообразования эндонуклеазы Есок1
2 Стехиометрический анализ Метод Фергюсона
2 Реакция гидролиза плазмидной ДНК
2 Реакция гидролиза модифицированного субстрата
2 Быстрые реакции Есок1
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Особенности ДНКбелкового взаимодействия
эндонуклеазы рестрикции Есок1
3.2. Стехиометрия комплекса Есок1 с ДНК
3.3. Каталитический механизм кинетика расщепления ДНК
эндонуклеазой рестрикции Есок1
3.4. Мутационный анализ каталитического центра
эндонуклеазы рестрикции Есок1
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


ИПТГ изопрогшл1 ii Значительные достижения последних лет в области молекулярной биологии и генной инженерии во многом связаны с успешным использованием ферментов нуклеотидного обмена. К числу таких ферментов относятся эндонуклеазы рестрикции, способные узнавать специфические последовательности нуклеотидов на ДНК и разрезать ее по определенным положениям. Среди всех известных к настоящему времени эндонуклеаз рестрикции, наиболее популярными остаются эндонуклеазы рестрикции типа II. Благодаря высокой специфичности и относительно простой структуре, эндонуклеазы рестрикции типа II служат великолепными моделями для изучения ДНКбелковых взаимодействий и эволюционных взаимосвязей среди разных ii белков. К настоящему моменту рентгеноструктурным анализом охарактеризовано эндонуклеаз типа II. Вопреки отсутствию гомологии на уровне аминокислотных последовательностей, рентгеноструктурным анализом удалось выявить общий для эндонуклеаз рестрикции типа II структурный мотив . X. Мотив . X содержит аминокислотные остатки существенные для каталитической активности этих белков. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей различных по функциональным особенностям белков выявил наличие мотива . X в белках, относящихся к другим классам. Тот факт, что разные ДНКсвязывающие белки имеют общий структурный мотив, дает основание предполагать существование общего, хотя и далекого предка. Интересным оказался тот факт, что среди эндонуклеаз рестрикции типа II существуют ферменты, имеющие в своей структуре консервативные мотивы неродственных фосфодиэстераз других классов и тем самым отличающиеся от типичных систем типа II семейства . X. Первым ферментом типа II, в структуре которого был обнаружен каталитический мотив нуклеазы семейства , была эндонуклеаза i тина II. Позднее с использованием современных методов сравнительного анализа аминокислотных последовательностей и структурного прогнозирования была обнаружена также гомология ряда ЭР типа II с хоминг эндонуклеазами семейств и II. Так, в структуре ряда эндонуклеаз рестрикции типа II со слабо выраженным подобием таких как, I, I, , II была отмечена консервативность повторяющихся , которые характерны для большинства ферментов семейства .