Роль маннозилтрансферазы Рmt1p в формировании молекулярного ансамбля клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha

• Автор: Соколов, Святослав Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил

Содержание
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: «Молекулярная композиция клеточной стенки дрожжей. Роль гликозилирования маннопротеинов в её формировании.»
1. Состав клеточной стенки дрожжей
2. Модификации белков клеточной стенки дрожжей
2.1. БГ-гликозилирование
2.2. О-гликозилирование
2.3. Гликозил-фосфоинозитольный «якорь»
3. Систематика белков по способу закрепления в клеточной стенке
3.1 Нековалентно связанные белки
3.2. Белки экстрагируемые ламинариназой
3.3. Белки экстрагируемые щёлочью
4. Строение клеточной стенки дрожжей
4.1. Локализация белков в клеточной стенке дрожжей
4.2. Химические связи между различными компонентами молекулярного ансамбля клеточной стенки.
4.3 Ферменты, вовлеченные в формирование ковалентных связей между компонентами в составе КС дрожжей.
5. Биосинтез О-связанных гликозидов и маннозилтрансферазы, вовлечённые в
данный процесс
5.1. Обнаружение О-маннозилтрансфераз
5.2. Трансмембранная топология РтИр
5.3. Формирование комплекса между маннозилтрансферазами РгШ-семейства
5.4. Фенотипические проявления нарушений РМТгенов
5.5. Специфичность РпИ белков к различным белковым субстратам
5.6. Роль О-маннозилирования

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
I. Используемые в работе реактивы
2 Штаммы и микроорганизмы
3. Состав сред и условия для выращивания микроорганизмов
4. Выделение КС
5. Обработка клеток и клеточных стенок гидролазами
6. Определение чувствительности клеток к Калькофлюору и Конго красному
7. Определение содержания нейтральных сахаров
8. Определение содержания аминосахаров
9. Определение белков в изолированных КС дрожжей
10 Определение сухого веса клеточных стенок
II. Биотинилирование клеток
12. Выделение белков из КС дрожжей
13. Выделение белков из среды роста дрожжей
14. Электрофоретические методы
15. Вестерн-блот анализ
16. Трансформация клеток E. coli
17. Трансформация дрожжевых клеток
18. Выделение плазмидной ДНК из E. coli
19. Выделение суммарной ДНК дрожжей
20. Гибридизация по Саузерну
21. Секвенирование фрагмента гена РМС1 5
22. Экстракция ДНК из агарозного геля после электрофоретического разделения
23.Измерение хитиназной активности.
24. Выделение хитиназы из среды роста дрожжей
25. Окраска белков при помощи нитрата серебра
26. Микроскопические методы
27. Компьютерный анализ белковых последовательностей

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Сравнение клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces
cerevisiae
1.1 Сравнительный анализ вклада белков и полисахаридов в поддержание целостности клеточной стенки дрожжей Candida utilis, Hansenula polymor-pha и Saccharomyces cerevisiae
1.2 Сравнение химического состава клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae
1.3 Сравнение чувствительности дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae к присутствию в среде культивирования ингибиторов роста клеточной стенки - Калькофлюора и Конго красного
1.4 Фракционирование и сравнение набора белков клеточных стенок дрожжей Hansenula polymorpha и Saccharomyces cerevisiae
2. Физиологические последствия нарушения гена РМТ1 Hansenula polymorpha!
2.1 Доказательство того, что изучаемый ген Hansenula polymorpha является функциональным гомологом РМТ1 Saccharomyces cerevisiae
2.2 Получение штамма Hansenula polymorpha с делецией гена РМТ1
2.3 Анализ гена, нарушение которого приводит к фенотипическим проявлениям сходным с проявлениями нарушения гена РМТ1 Hansenula polymorpha
2.4 Изменения в уровне О-гликозилирования у штамма Hansenula polymorpha с нарушенным геном РМТ1 на примере хитиназы
2.5 Фенотипические проявления, возникающие у дрожжей
Hansenula polymorpha при нарушении гена РМТ1.
3. Влияние делеции гена РМТ1 на структуру клеточной стенки дрожжей Hansenula polymorpha
3.1 Сравнение чувствительности клеточных стенок pmtl дизруптанта и исходного штамма Hansenula polymorpha к действию гидролитических ферментов
3.2 Сравнение химического состава клеточных стенок дрожжей
Hansenula polymorpha дикого типа и pmtl дизруптанта

5. Биосинтез О-связанных гликозидов и маннозилтрансферазы, вовлечённые в данный процесс.
Данная глава посвящена подробному рассмотрению процессов
вовлечённых в биосинтез О-гликозидных цепей, а также описанию маннозилтрансфераз, осуществляющих данные реакции.
Реакцию присоединения первого остатка маннозы на сериновый или треониновый остаток белка катализирует интегральный мембранный белок О-а-d-маннозилтрансфераза (Pmtlp). Донором маннозы для данной реакции служит долихол-фосфат-манноза, причём манноза переносится из долихол-фосфат-ß-d-маннозы с инверсией конфигурации на a-d форму (Bause E. et а!., 1979). Причём долихол фосфат-связанная манноза служит донором только первого маннозного остатка гликозидной цепи, присоединяясь непосредственно к белку, а донором последующих маннозных остатков является GDP-манноза (Рис 2) (Babczinsky Р. et al., 1973, Sharma С.В. et al., 1974).
Ферменты, синтезирующие долихол-фосфат-маннозу (Dpmlp), были выделены и кодирующие их гены клонированы путём скрининга на сверхпродукцию (Orlean Р. et al., 1988, Haselbeck A. et al., 1989). Оказалось, что существует два типа синтетаз, одна у S.cerevisiae, Tripanosoma brucei и Ustilago maydis, другая, отличающаяся отсутствием С-концевого трансмембранного домена, у Schizosaccharomyces pombe, нематоды Caenorhabditis briggsiae и у человека (Colussi P.A. et al., 1997). Нокаут гена DPMI, кодирующего синтетазу Dol-P-маннозы, ведёт к полной потере О-маннозилирования у белков (Orlean Р. et al., 1990).
Белки Dpmlp и Pmtlp локализованы в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), (Marriott М. et al., 1979, Haselbeck A. et al., 1983). Локализация Pmtlp была подтверждена мембранным фракционированием в сахарозном градиенте (Strahl-Bolsinger S. et al., 1991, Gentzsch M. et al., 1996). Предполагается, что начальные стадии О-маннозилирования происходят котрансляционно (Orlean Р. et al., 1990, Ernst J.F., 2001). Долихол-фосфат маннозилируется на цитоплазматической стороне ЭПР и до сих пор не выяснено, как именно переносится в люмен, где