Структура и РНК-связывающие свойства бактериального регулятора экспрессии генов-белка Hfq

• Автор: Васильева, Юлия Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 94 с. : ил.

Содержание
Содержание

Список сокращений

Введение
1. Обзор литературы. Регуляторная роль белка в жизнедеятельности бактериальных клеток

1.1. Образование комплексов белка с некоторыми мРНК

как фактор регуляции трансляции

1.2. Участие белка в регуляции трансляции мРНК малыми нетранслируемыми РНК . i

1.3. белок, неспецифически связывающийся с РНК

1.4. Роль I в метаболизме полиА

1.5. Участие в формировании бактериального нуклеоида

1.6. Белок подобный белок бактерий
1.7. Пространственные структуры белка и его гомологов
Заключение
2. Материалы
2.1. Химические реактивы и ферменты
2.2. Растворы
2.3. Питательные среды
2.4. Бактериальные штаммы
2.5. Плазмиды
3. Методы
3.1. Методы генной инженерии
3.1.1. Выделение хромосомной ДНК . i
3.1.2. Выделение плазмидной ДНК . i
3.1.3. Очистка плазмидной ДНК равновесным центрифугированием в градиенте
3.1.4. Получение компетентных клеток . i
3.1.5. Трансформация компетентных клеток плазмидной
3.1.6. Получение штаммасуперпродуцента белка
. i
3.1.7. Получение штаммасуперпродуцснта белка
. i
3.1.8. Получение штаммов, продуцирующих
селенометнониновые производные белков II и
3.1.9. Получение конструкций для транскрипции i vi
x, , и РНК
Содержание
3.2. Методы работы с белками
3.2.1. Выделение и очистка рекомбинантного белка II
3.2.2. Выделение и очистка рекомбинантного белка
3.2.3. Гельэлектрофорез белков в ПААГ в присутствии
3.3. Анализ гомогенности и оценка молекулярных весов полученных препаратов и
3.3.1. Проведение гельфильтрационной хроматографии препарата белка
3.3.2. Проведение аналитического ультрацентрифугирования в шлиренсистеме препаратов белков и
3.4. Методы работы с РНК и РНКбелковыми комплексами
3.4.1. Т7 транскрипция i vi x, , и
3.4.2. Гельэлектрофорез РНК в ПААГ в присутствии 8 М
мочевины
3.4.3. Получение и очистка равномерно Рмеченных , и РНК
3.4.4. Определение кажущихся констант диссоциации РНКбелковых комплексов
3.4.5. Метод гельшифта
3.5. Кристаллизация белка
3.6. Сбор дифракционных данных
4. Результаты и их обсуждение
4.1. Получение штаммовсуперпродуцентов белков . i и Р. i
4.2. Выделение гомогенных растворимых препаратов белков и из штаммовсуперпродуцентов
4.3. Проверка гомогенности полученных белковых препаратов
4.4. Получение регуляторных , , и x РНК
. i
4.5. Исследование РНКсвязывающих свойств белков . i и . i
4.6. Кристаллизация белка . i
4.7. Сбор дифракционных данных Выводы
Список цитируемой литературы


молекулярный вес белок Р. Изучение регуляции экспрессии генов является одной из наиболее важных задач молекулярной биологии. Осуществление контроля экспрессии генов происходит как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции и представляет собой достаточно сложную систему взаимодействий многих молекул. Для детального понимания механизмов этого процесса необходимо знание структурной организации различных его компонентов. Белок является одним из ключевых регуляторов экспрессии бактериальных генов. Он контролирует трансляцию многих клеточных мРЫК. РНК. Механизм взаимодействия белка с РНК пока ещ не известен. Данный белок является высококонсервативным среди бактерий, его гомологи найдены также у архей и эукариот. На сегодняшний день определены пространственные структуры нескольких эукариотических и архейных гомологов , а также недавно решены структуры двух бактериальных белков . Данная диссертация посвящена разработке методов выделения белков бактерий ii i и i, изучению их РИКсвязывающих свойств, а также кристаллизации белка для структурных исследований. Полученные штаммысуперпродуценты белков . Р. i используются для препаративного выделения данных белков. Ауксотрофные по метионину штаммысуперпродуценты белков . Р. i используются для препаративного выделения тяжелоатомных производных данных белков, у которых атомы серы в метиониновых остатках заменены атомами селена. . Р. i в больших количествах. Полученные специальные конструкции с клонированными иод контроль Т7промоторов измененными генами регуляторных x, , и РНК . РНК в препаративных количествах с минимальными затратами ресурсов. Получены комплексы белков . Р. i с регуляторными , и РНК. Исследована стабильность данных комплексов, и измерены константы их диссоциации в разных солевых условиях. Проведен поиск условий кристаллизации и получены кристаллы Р. Нативные кристаллы и их тяжелоатомные производные использованы для сбора кристаллографических данных и определения пространственной структуры белка Р. Полученные штаммысуперпродуценты, разработанные методики выделений и выделенные нами препараты белков . Р. i, а также конструкция для транскрипции i vi малой регуляторной x РНК, связывающейся с белком , используются для функциональных исследований в Институте молекулярной генетики Вена, Австрия. Обзор литературы. другое название 1 является высококонсервативным термостабильным бактериальным белком с молекулярной массой около кДа. Он кодируется геном , расположенным в хромосоме ii i на . ii Ii, и входящим в состав i оперона i i, . Экспрессия гена заметно увеличивается в стационарной фазе роста клеток i . был открыт в конце х годов прошлого столетия как клеточный белок . i vi ii Ii, . . . В более поздних экспериментах i viv было показано, что плавит 3конец цепи фаговой РНК и обеспечивает взаимодействие РНК и начало синтеза цепи . i . В неинфицированных бактериальных клетках белок является полифункциональным регулятором трансляции большого числа мРНК, включая мРНК белков репарации ДНК i . действует как прямо связываясь с мРНК контролируемого гена и стимулируя е трансляцию, синтез полиЛ или деградацию, так и опосредованно через стимуляцию трансляции мРНК другого глобального клеточного регулятора субъединицы бактериальной РНКполимеразы. . обладает сильным сродством к РНК, в особенности к богатым последовательностям i, . В нескольких работах биохимическими методами и с помощью электронной микроскопии было показано, что бактериальный в растворе существует в виде гексамера . Васильева и др. .