Новый метод создания нормализованных библиотек КДНК с использованием дуплекс-специфической нуклеазы камчатского краба

• Автор: Жулидов, Павел Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 90 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Экспрессия пи юв в эукариотической клетке.

1.2 Подходы К ПОИСКУ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО экспрессирующихся генов и определению характерных профилей экспрессии.

1.3 ПОДХОДЫ К ПОИСКУ РЕДКИХ ГЕНОВ И КРУПНОМАСШТАБНЫЕ ПРОЕКТЫ ПО СЕКВЕНИРОВАНИЮ.

1.4 ПОДХОДЫ К СОЗДАНИЮ НОРМАЛИЗОВАННЫХ БИБЛИОТЕК.

1.5 Описание кинетики процесса реассоциации нуклеиновых кислот в растворе

1.6 Способы отделения одноцепочечиой фракции нормализованных молекул кДНК

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1 ДСП
2.2 Проверка пригодности ДСП для изоляции оц ДНК из смеси нуклеиновых кислот
2.3 Создание нормализованных библиотек кДНК
2.4 Модельный экспериментсоздание нормализованной библиотеки кДНК из скелетной МЫШЦЫ ЧЕЛОВЕКА.
2.5 Проверка воспроизводимости метода. Создание нормализованных библиотек из кДНК различных тканей человека
2.6 СОЗДАНИЕ НОРМАЛИЗОВАННОЙ БИБЛИОТЕКИ КДНК ИЗ НЕЙРОНОВ АРЬУА САиРОДЬИСА
2.7 СОЗДАИЕ1ЮРМАЛИЗОВА1П1ЫХ БИБЛИОТЕК ДЛЯ АПРАВЛЕ1IIЮГО КЛ1ИРОВАИЯ.
2.8 НАПРАВЛЕ1ИЮЕ УДАЛЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕ1II1ЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЫЮСТЕЙ
2.9 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1 Материалы и оборудование.
3.2 Методы исследования
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Уровень экспрессии генов может существенно варьировать в зависимости от условий например, в зависимости от стадии развития, условий окружающей среды, наличия различных патофизиологических процессов и т. Экспрессия целого ряда генов может быть обнаружена только на определенных стадиях эмбриогенеза и не встречается во взрослых тканях тогда как экспрессия друптх генов специфична только для взрослого организма. Биологические системы очень сложны и уровень экспрессии гена определяется нс только на уровне транскрипции. С точки зрения функции наиболее важным является количество и активность соответствующего белка. Посттранскрипционная модификация, трансляция, посттрансляциоииая модификация, транспорт вес эти процессы не могут идти со 0 эффективностью i, а , , но недостаточную эффективность какоголибо из этапов экспрессии гена необходимо компенсировать. Предполагается, что именно с этим связан более высокий средний уровень экспрессии ГПКГ по сравнению со средним уровнем экспрессии генов в клетке. Для большей части транскриптов характерен низкий уровень представленности мснсс пяти копий на клетку, в то время как для ГПКГ характерен средний уровень представленности около копий на клетку. Конечно, ряд генов строго регулируется па уровне транскрипции, однако в случае ГПКГ, повидимому, нет необходимости в столь строгой регуляции количества транскриптов. При наличии избыточного пула транскриптов ГПКГ регуляция экспрессии может осуществляться на уровне трансляции, за счет чего обеспечивается быстрый ответ на изменяющиеся потребности в том или ином белке. Впрочем, до сих пор возникает вопрос какие различия в уровне экспрессии гена можно считать биологически значимыми Для большинства генов, повидимому, разница в уровнях экспрессии в 34 раза не имеет особого значения. Однако для ряда генов даже небольшие изменения уровня экспрессии играют существенную роль в клетке. В первую очередь это относится к генам, кодирующим белки, которые могут связываться с рецепторами с различной афиниостыо в зависимости от концентрации, а также к генам, кодирующим белки регуляторных каскадов i . К сожалению, точного ответа на вопрос о значимости небольшой разницы в уровнях экспрессии как на уровне транскрипции, так и в целом на данный момент не существует, что, в первую очередь, связано с недостаточной чувствительностью и точностью методов оценки количества определенных мРНК в клетке, существующих на данный момент. Очевидно, чго именно те гены, уровень экспрессии которых изменяется в ходе различных процессов дифференцировка, различные патофизиологические изменения привлекают наибольшее внимание исследователей, поскольку изучение дифференциально экспрессирующихся генов ДЭГ может привести к пониманию молекулярных механизмов этих процессов и именно эти гены являются потенциальными мишенями для генной терапии. ii . Суть метода состоит в проверке уровня представленности случайно выбранных последовательностей клонов кДНК в сравниваемых образцах РНК при помощи гибридизации с целыо выявления последовательностей, присутствующих в одном из сравниваемых образцов в гораздо большей концентрации, чем в другом. Очевидным неудобством подобного анализа неупрощенных популяции РНК является высокая трудоемкость, так как популяция транскриптов ДЭГ редко составляет более 1 от всей РНК. Таким образом, поиск единственного ДЭГ мог потребовать сотен раундов гибридизации. Для повышения эффективности дифференциального скрининга был предложен целый ряд методов, таких как дифференциальный дисплей мРНК, вычитающая гибридизация, серийный анализ экспрессии генов i i xi, и гибридизация с иммобилизованными на твердом носителе олигонуклеотидами и фрагментами кДНК различные виды ДНКэрреев и микроэррсев. Под термином дифференциальный дисплей ДЦ подразумевают группу методов, направленных на идентификацию транскриптов дифференциально экспрессирующихся генов т. РНК, представленных в разной концентрации в сравниваемых образцах путем сравнения популяций мРНК на полиакриламидном геле.