Разработка и использование флуоресцентных ДНК-зондов для лигазной цепной реакции в режиме реального времени

• Автор: Малеев, Григорий Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Черноголовка
• Количество страниц: 123 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
Глава 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР. Лигазная цепная реакция и методы флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот

1.1. Лигазная цепная реакция для детекции нуклеиновых кислот

1.1.1. Теоретические основы метода ЛЦР

1.1.2. Практическое применение ЛЦР

1.1.3. Проблемы метода ЛЦР в сравнении с методом ПЦР

1.2. Флуоресцентные методы детекции нуклеиновых кислот

1.2.1. Флуоресцентные методы детекции. Базовые сведения

1.2.2. Методы прямого проявления

1.2.3. Системы детекции, основанные на резонансном переносе энергии флуоресценции

Глава 2. Разработка систем детекции продуктов ЛЦР на основе флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов
2.1 Олигонуклеотидные зонды на основе полициклических ароматических угледоводородов
2.1.1. Пиреновый бифлуорофор с эксимерной флуоресценцией
2.1.2. Зонды на основе псевдонуклеозидного пиренсодержащего флуорофора
2.1.3. системы при внедрении пирена и перилена в комплементарные олигонуклеотиды
2.2. Олигонуклеотидные зонды на основе флуоресцеиновых и родаминовых красителей
Глава 3. Новые методы детекции. ДНК и РНК при помощи ЛЦР в режиме реального времени
3.1. ПЦР и ЛЦР в режиме реального времени особенности и сферы использования
3.2. Лигазная цепная реакция в режиме реального времени основные принципы.
3.3. ЛЦРРВ, основанная на детекции дву цепочечной ДНК при помощи красителя I.
3.4. Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте эксимерной флуоресценции
3.5. Схема детекции продуктов ЛЦР, основанная на эффекте изменения анизогропии флуоресценции
3.6. Схемы детекции продуктов ЛЦР, основанные на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции
3.6.1. между полициклическими ароматическими флуорофорами
3.6.2. ЛЦРРВ, основанная на эффекте резонансного переноса энергии флуоресценции между красителями и X
3.7. Оптимизация условий ЛЦРРВ
3.8. Детекция молекул РНК при помощи ЛЦРРВ
3.9. Использование разработанных вариантов ЛЦРРВ в молекулярногенетических исследованиях
Глава 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1 Реактивы и материалы
4.2. Экспериментальные методы
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
БЛАГОДАРНОСТИ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Общества биотехнологов России Москва , третьем съезде Общества биотехнологов России Москва , международном конгрессе Тенденции в химии нуклеиновых кислот Москва, ноября , международном симпозиуме Трансгенные растения и проблемы биобезопасности Москва , 2ой международной конференции БиотехнологияБиомедицинаОкружающая среда Пущино, мая . Глава 1. Лигазная цепная реакция ЛЦР является одним из перспективных методов клинической диагностики, интенсивно развиваемым на практике в последние полторадва десятилетия. По чувствительности и точности анализа ЛЦР во многих случаях демонстрирует превосходство не только над классическими методами микробиологического анализа, такими как выращивание культур клеток, иммунохимический анализ, но также и над современными вариантами ПЦРдиагностики. В первой части настоящего обзора рассмотрены теоретические основы методологии ЛЦР, описаны типичные экспериментальные процедуры, приведены реальные примеры использования ЛЦР в современной диагностической практике, а также рассмотрены проблемы метода ЛЦР в сравнении с ПЦР. Во второй части обзора представлены теоретические и прикладные аспекты ряда наиболее употребительных современных методов флуоресцентной детекции нуклеиновых кислот, которые являются необходимыми для понимания основных подходов, реализованных в настоящей диссертационной работе. ЛЦР, впервые описанная в году 1, является двустадийной вариацией ПЦРметодологии, в которой для селективной амплификации некоторой заранее известной ДНКпоследовательности используется не полимеразный, а лигазный фермент. Этот метод основан на дискриминирующей неспособности ДНКлигазы лигировать т. ДНК. ДНК, но даже точечные мутации мутации, приводящие к замене или вставке всего одного нуклеотида в данной последовательности. Последняя особенность является наиболее примечательной, так как детекция точечных мутаций представляет собой непростую и практически важную задачу. ЛЦР является методом амплификации ДНК, который может быть использован для детекции следовых количеств известных ДНКпоследовательностей. В типичном ЛЦРанализе вначале синтезируют два набора смежных ол иго нуклеотидных праймеров, которые способны к комплементарному связыванию со специфическим детектируемым регионом одноцепочечной ДНК. Последняя образуется в результате денатурации нативной двухцепочечной ДНК, взятой из анализируемого образца. ДНКлигаза будет лигировать только те соседние праймеры на ДНКматрице, которые полностью ей комплементарны. Продукты лигирования, образующиеся в результате описанного цикла, служат в качестве матриц для следующих циклов ЛЦР. Так, по аналогии с экспоненциальной амплификацией матрицы в ПЦР, ЛЦР приводит к экспоненциальной амплификации продуктов лигирования. После определенного числа циклов ЛЦР количество этих продуктов лигирования становится достаточным для детекции. Рис. Две пары олигонуклеотидных зондов из контрольного набора реагентов в i. Олигонуклеотиды А и фосфорилированы по 5концам в процессе синтеза. Принцип ЛЦРамплификации может быть проиллюстрирован на следующем примере, взятом из инструкции компании к своему коммерческому продукту набору реагентов для проведения ЛЦР i. Ii . . Контрольные реагенты в коммерческом наборе для ЛЦРанализа компании включают в себя две плазмидных ДНКматрицы детектируемые мишени, принадлежащие дикому и мутантному типам. Дикий тип содержит нормальную последовательность гена, в то время как мутантный тип содержит СТ транзитную мутацию в 1 нуклеотиде. Набор также включает в себя четыре нуклеотидных зонда, составляющих две комплементарных пары. В первой паре олигонуклеотиды А и В являются смежными и комплементарными одной из цепей ДНКмишени. Олигонуклеотиды С и , составляющие вторую пару, комплементарны первой паре и, следовательно, комплементарны второй цепи ДНКмишени. Рис. Часть нормальной последовательности , содержащая сайт мутации в положении 1 выделен жирным. Часть нормальной последовательности , содержащая сайт мутации, показана на рисунке 1. Нуклеиновое основание С положение 1, выделенное жирным шрифтом, в мутантной последовательности заменено на Т.