Роль фосфорилирования белка оболочки X-вируса картофеля в трансляционной активации вирионной РНК

• Автор: Заякина, Ольга Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ПРОТЕИНКИНАЗЫ РАСТЕНИЙ

КЛАССИФИКАЦИЯ ПРОТЕИНКИНАЗ РАСТЕНИЙ

Калышйзависимые протеинкиназы

Протеин киназы, родственные БМ7

Рецепторподобные протеинкиназы

Подсемейства МАРкиназ МАРК. МАРКК и

Пиклинзависимые киназы

Подсемейства казеинкиназы 1 ККП и казеинкиназы 2 КК2

ФОСФОРИЛИРОВАННЕ ВИРУСНЫХ БЕЛКОВ

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ
Фосфорилирование транспортного белка вируса табачной мозаики ВТМ и его роль в развитии вирусной инфекции
Фосфорилирование транспортного белка вируса мозаики томата
Фосфорилирование транспортных белков других вирусов растений
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ НЕСТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ
Фосфорилирование 2а компонента репликазы вируса
мозаики огурца
Фосфорилирование и убиквитинирование РНКзависимой РНКполимеразы вируса желтой мозаики
турнепса ВЖМТ
Фосфорилирование белка вируса розсточной карликовости пшеницы
Фосфорилирование белка 2 вируса карликовости риса
ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ
Фосфорилирование капсидного белка вируса мозаики цветной капусты
Фосфорилирование белка V Авируса картофеля
Фосфорилирование белка оболочки вируса картофеля Фосфорилирование и гликозилирование белка оболочки вируса шарки сливы
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле
Получение препарата растворимой
цитоплазматической. фракции
Фосфорилирование i vi
Анализ протеинкиназной активности фракции листьев .i с использованием ингибиторов протеинкиназ
Трансляция в бесклеточной белоксинтезирующей системе из экстракта зародышей пшеницы
Иммуноблот
Заражение растений ХВК
Измерение уровня протеинкиназной и
протеинфосфатазной активности фракции листьев М. i
Выделение препарата Хвируса картофеля
Обработка препарата ХВК трипсином
Выделение плазмидной ДНК
Получение мутанта ХВК с заменами остатков серина и треонина вЫконце белка оболочки мутанта
Высокоэффективная жидкостная хроматография
Анализ углеводных остатков в составе триптических пептидов
Гидролиз карбоксипептидазой
Массспектрометрия
Инфракрасная спектроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. В фосфорилировании белка оболочки ХВК растворимой фракцией листьев . i i vi. участвует протеинкиназа, сходная с казеинкиназой 2
2. Смесь КК 1 и КК2 способна фосфорилировать белок оболочки ХВК в составе вирионов и трансляционно активировать инкапсидированную РНК
3. Фосфорилирование белка оболочки ХВК i i не влияет на инфекционность вируса
4. Уровень протеинкиназной и протеинфосфатазной активности в хозяйских клетках изменяется в ходе
развития вирусной инфекции
. Удаление концевого фрагмента БО в составе
вирионов ХВК подавляет способность вируса трансляционно активироваться фосфорилированием
6. Инфекционность препаратов ХВКР1с1 снижена по
сравнению с нативным ХВК
7. Замена потенциально фосфорилируемых аминокислотных остатков в Ыконие БО влияет на способность инкапсилированной РНК транслироваться
8. Изменения структуры вирусной частицы, внесенные фосфорилированием, являются необратимыми
9. 5конец РНК ХВК доступен для взаимодействия с комплементарным олигонуклеотидом в составе фосфорилированного ХВК и 5ТХВК, но не нативного или комплекса ХВКТБ
. Ыконцевой фрагмент белка оболочки ХВК Огликозилирован
. Структура Ыконца белка оболочки ХВК влияет на способность вириона связывать воду
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


На современном этапе развития вирусологии растений большой интерес представляет изучение молекулярных механизмов межклеточного транспорта вирусной инфекции, регуляции процессов трансляции и репликации вирусных нуклеиновых кислот, а также принципов взаимодействия вируса с клетками растенияхозяина. В момент заражения растения вирусом только небольшое число клеток оказывается инфицированным. Для дальнейшего распространения инфекции необходим межклеточный транспорт, который является активным процессом, осуществляется через плазмодесмы и требует участия одного или более кодируемых вирусом транспортных белков. Вирусная РНК перемещается из зараженной в соседние здоровые клетки в составе нуклеопротеидной структуры транспортной формы. Повидимому, в составе транспортной формы вирусная РНК исключается из процессов трансляции и репликации, а после проникновения в здоровую клетку вновь становится доступной рибосомам для трансляции и продолжения развития инфекции. Механизмы регуляции описанных процессов и роль факторов клеткихозяина в процессе транспорта инфекции мало изучены. На примере транспортной формы ВТМ было показано, что РНК в комплексе с транспортным белком недоступна для рибосом, однако фосфорилирование транспортного белка подавляет его репрессирующую активность, делая возможной трансляцию v . Трансляция РНК ВТМ родительских частиц в первично зараженных клетках происходит в результате процесса котрансляционного раздевания РНК рибосомами i , . Объект нашего исследования, X вирус картофеля ХВК типичный представитель рода xvi. Роль транспортной формы потексвирусов выполняют либо зрелые вирусные частицы . РНК с белком оболочки БО и одним из трх транспортных белков ТБ1 . Ранее в нашей лаборатории было показано, что, в отличие от ВТМ, РНК ХВК в составе вирусных частиц недоступна для трансляции i vi, но приобретает способность транслироваться в результате а взаимодействия вириона с транспортным белком ТБ1 ХВК либо б фосфорилирования белка оболочки БО v . Настоящая работа была посвящена дальнейшему исследованию роли фосфорилирования белка оболочки ХВК в трансляционной активации инкапсидированной РНК, характеристике прогеинкиназ, способных фосфорилировать БО ХВК в клетках растенияхозяина, выявлению сайтов фосфорилирования и анализу влияния их мутационной модификации или делеции на свойства вириона и возможность трансляционной активации РНК. Обратимое фосфорилирование белков фундаментальный процесс, участвующий в регуляции практически всех аспектов жизни клетки. Важность этого явления отражает большое количество протеи нкиназ и протеинфосфатаз различной специфичности, присутствующих в эукариотической клетке. В частности, геном человека кодирует порядка протеинкиназ , . Примерно белков в эукариотической клетке содержат ковалентно связанный фосфат, и аномальный уровень фосфорилирования является причиной или следствием серьезных нарушений функций клетки , . Вирусные белки, попадая в клетку, могут также подвергаться фосфорилированию дефосфорилированию клеточными киназами и фосфатазами, и вирусы могут использовать эти процессы для регуляции собственных функций в ходе развития инфекции. По имеющимся данным геномы большинства растительных вирусов не кодируют собственных протеинкиназ. Исследование протеинкиназ растений, количество описанных первичных последовательностей и тем более понимание их физиологических функций сильно отстает от аналогичных исследований, проведенных на дрожжах и млекопитающих. Многие последовательности в базах данных охарактеризованы как протеинкиназы только на основании гомологии с известными нерастительными протеинкиназами, а об их реальных функциях в клетке, характере экспрессии и регуляции ничего не известно. Однако растения эволюционировали независимо от грибов и животных на протяжении, возможно, миллиарда лет и многие их системы имеют существенные отличия. Например, в растениях до сих пор не обнаружены тирозинкиназы i, , играющие важную роль в передаче сигналов в животной клетке, а гены, участвующие в ответе на этилен и цитокинины в . Ответ на сигнальные молекулы, поступающие извне, например, гормоны . Участие в защитных реакциях при проникновении чужеродных агентов i i, i , . Регуляция клеточного цикла i . Ответ на неблагоприятные условия окружающей среды, например, осмотический стресс .