Структурно-функциональная Notl-кластеров генома человека : Short-Notl клоны и репрезентативный дифференциальный анализ

• Автор: Будилов, Артем Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 178 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ГЕНОСЕЦИФИЧНЫЕ КЛОНОТЕКИ. ОСТРОВКИ КАК МАРКЕРЫ ГЕНОВ.

1.1.1. Методы детекции I, использующие специфнчные эндонуклеазы рестрикции.

1.1.2. Прыжковые и связующие ЛМклонотеки.

1.2. ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ РИБОСОМНОЙ РНК

1.3. СРАВНИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЕНОМОВ. ВЫЧИТАЮЩАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ

1.3.1. Принципы вычитающей гибридизации.

1.3.2. Вычитающая гибридизация геномов

1.3.2.1. Вычитающая гибридизация без использования ПЦР

1.3.2.2. Использование ПЦР в вычитающей гибридизации.

1.3.2.3. Репрезентативный дифференциальный анализ
1.4. СВОБОДНО МИГРИРУЮЩИЕ ДНК ЭУКАРИОТ НОВЫЙ ТИП
ЭКСТР АХРОМОСОМНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ ИЛИ РЕЗУЛЬТАТ
СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ДЕГРАДАЦИИ ХРОМАТИНА.
1.4.1. Свободно мигрирующие ДНК, выявляемые методом пульсэлектрофореза интактиой ДНК из клеток эукариот
1.4.2. Известные экстрахромосомные элементы эукариотической клетки.
1.4.3. Некоторые особенности организации хроматина эукариот.
1.4.3.1. Центральная догма
1.4.3.2. Петельнодоменная организация хроматина и регуляция его топологических состоянии
1.4.3.3. Крупноблочная деградация хромосомной ДНК в начальных стадия
апоптоза.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Бактериальные штаммы и плазмидные векторы
2.1.2. Реактивы.
2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.2.1. Выделение геномной ДНК.
2.2.2. Трансформация клеток Е.соН плазмидной ДНК
2.2.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.2.6. Электрофорез ДНК в агарозном геле и элюция фрагментов ДНК из
легкоплавкой агарозы
2.2.5. Пульсэлектрофорез интактной ДНК из культивируемых клеток таЬуа
2.2.6. Выделение высокомолекулярной интактной ДНК из легкоплавкой агарозы.
2.2.7. Электрофорез ДНК в ПААГ
2.2.8. Получение направленной МоНклонотеки.
2.2.9. Первичный анализ ГЧоПклонов .
2.2 Получение клонотеки из 6ДНК.
2.2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2.2 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей.
2.2 Анализ природы МоНполиморфизма локуса рДНК в районе
второго внутреннего спейсера
2.2 Репрезентативный дифференциальный анализ.
2 Подготовка ЬДНК и хрДНК для вы читающей гибридизации
2 Вычитающая гибридизация.
2.2 Подтверждение принадлежности клонов ЛВ и ЛОЗ В к 6ДНК методом IIЦР
2.2 Приготовление радиоактивно меченного ДНКзонда.
2.2 Блотгибридизация ДНК
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. КЛОНОТЕКА ЗНСЖТАоАФРАГМЕНТОВ И ЕЕ АНАЛИЗ.
3.1.1. Получение библиотеки хАогРьЛоНклонов.
3.1.2.Составленне банка индивидуальных 5Ног4оПклочов.,.
3.1.3. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей.
3.1.4. Анализ распределения ДГкластсров в геноме человека и грызунов 3.1.5 ДШполиморфизм генов рибосомной РНК человека.
3.2. АУВАРИАНТ РЕПРЕЗЕНТАТИВНОГО ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОГО АНАЛИЗА В ИЗУЧЕНИИ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ ФРАКЦИЙ, ПОЛУЧАЕМЫХ ПУЛЬСФОРЕЗОМ ИЗ ИНТАКТНЫХ ДНК КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ. ,,,
3.2.1. ЛМвариант репрезентативного дифференциального анализа обоснование и смысл модификации. х
3.2.2. Некоторые особенности свободно мигрирующих ДНК.
3.2Л. Л9РДА в изучении свободно мигрирующих ДНК
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Все это выгодно отличает их от маркеров, полученных на основе кДНК и позволило эффективно использовать островки для поиска новых генов и картирования генома человека. Хотя существующие методы детекции островков немногочисленны, их можно условно разделить на две группы. Первую группу составляют методы, которые предполагают непосредственное выделение островков из тотальной или клонированной геномной ДНК при помощи, например аффинной хроматографии на колонках, содержащих метилСрОсвязывающий домен iii i крысиного белка МеСР2 9, сегрегации богагых последовательностей i при градиентном денатурирующем гельэлектрофорезе , или ПЦРамплификации с использованием обогащенного праймера И. Эти методы позволяют идентифицировать лишь часть островков, а кроме того требуют дополнительных манипуляций например, блотгибридизационного анализа для установления места локализации получаемых последовательностей. Это значительно усложняет весь процесс идентификации, поскольку выявляемые фрагменты имеют богатый состав, и, как правило, небольшие размеры. Iспецифичными, т. Методы детекции I, использующие специфичные эндонуклеазы рестрикции. Разработан метод ПЦРидентификации генов i I, ассоциированных с островками в искусственных дрожжевых хромосомах или космидах . Клонированную ДНК гидролизуют при помощи специфичных эндонуклеаз рестрикции , и II . Полученные фрагменты лигируют с векторетными линкерами и затем проводят ПЦРамплификацию с праймерами, специфичными к линкерам и к повторам. По замыслу авторов, в большинстве случаев ПЦРамплификаты должны содержать 5концы связанных с островками генов. Данный метод хотя и оперативен, но не отличается высокой эффективностью и имеет существенный недостаток позволяет обнаружить только островки, фланкированные повторами. Интересным представляется способ при помощи которого были выявлены новые субстраты ДНКсвязывающих доменов транскрипционных факторов, относящихся к семействам рецепторов ретиноевой кислоты и ретиноидных рецепторов X X . Метод основан на предположении, что регуляторные последовательности, с которыми взаимодействует данных класс транскрипционных факторов, могуг быть расположены в I. ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции I и iI и лигирование коротких фрагментов 0 п. После ПЦРамплификации с использованием специфичных к адаптерам радиоактивномеченных затравок, проводят конкурентное связывание всей популяции последовательностей с полученными i vi белками и X. Возможные субстраты ДНКсвязывающих доменов этих белков определяют по изменению подвижности гибридных молекул в полиакриламидном геле ii i . Несколько раундов селекции и амплификации позволили авторам идентифицировать новых и Xзависимых последовательностей, одна из которых оказалась регуляторным элементом нового зависимого гена с неизвестными функциями. К сожалению описанный способ позволяет идентифицировать только те белки, транскрипция которых регулируется уже известными факторами. Кроме того, необходимо наличие эффективной системы экспрессии этих факторов i vi. Повидимому, наиболее удачным примером использования возможностей островков, как маркеров функционально значимых последовательностей, можно считать связующие и прыжковые Агбклонотеки. Прыжковые и связующие Аоклонотеки. Идея создания прыжковых и связующих клонотек, принадлежит i и i . Геноспецифичными их сделал . Как позднее выяснилось сайты узнавания расположены преимуществешо в островках и, следовательно, маркирую гены . Хотя методические приемы, предложенные в пионерских работах, со временем претерпели существенные изменения идеология прыжковых и связующих клонотек осталась неизменной. Основная идея метода представлена на рисунке 1. Прыжковый
i
Рисунок 1. Схема расположения нуклеотидных последовательностей, прилегающих к участкам узнавания в геномной ДНК, в связующих и прыжковых клонах. В участки узнавания рестриктаз ВатШ, или . Стрелками показаны направления секвенирования клонированной ДНК с прямого и обратного праймеров. Двойной стрелкой показаны непрерывные , образованные секвенированными последовательностями связующих клонов.