Выявление маркеров цитомегаловируса у новорожденных и детей раннего возраста. Развитие апоптоза при цитомегаловирусной инфекции in vitro

• Автор: Меджидова, Марина Гудовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Цнтомегаловирус человека структура и репликация.

1.1. Структура и организация генома

1.2. Репликация цитомегаловируса

Глава 2. Методы лабораторной диагностики цитомегаловирусной инфекции.

2.1. Культуральные методы

2.2. Непосредственное определение вирусных антигенов

в клинических образцах

2.3. Определение нуклеиновых кислот вируса
2.4. Серологические методы
Глава 3. Действие цитомегаловируса на программированную клеточную гибель.
3.1. Ингибирование апоптоза в ЦМВ инфицированных клетках.
3.2. Влияние вирусных белков на программированную клеточную гибель.
3.3. Анализ клеточных факторов, участвующих в апоптозе.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Основные реактивы и препараты, используемые в работе
Культура клеток и вирус
Определение инфекционной активности вируса
Синхронизация ФЛЭЧ
Иммуноцитохимический метод
Определение целостности цитоплазматической мембраны фибробластов
Выявление активированной каспазы3 и фрагментированной ДНК Пациенты
Исследуемый материал
Быстрый культуральный метод БКМ
Твердофазный иммуноферментный анализ тИФА
Иммуноблот
Авидность антител
Полимеразная цепная реакция ПЦР
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 5. Выявление маркеров ЦМВ у новорожденных и детей раннего возраста.
5.1.Повышение чувствительности выявления инфеционно активного вируса с помощью БКМ.
5.2.Частота обнаружения маркеров ЦМВ у недоношенных и маловесных новорожденных детей с использование количественных вариантов БКМ, ПЦР и методов серодиагностики.
5.3. Выявление маркеров ЦМВ у детей раннего возраста.
5.4. Сравнение эффективности выявления ЦМВ в клинических образцах методом ПЦР и БКМ.
5.5. Сравнительный анализ коммерческих тестсистем, выявляющих антиЦМВ антитела I и I.
Глава 6. Влияние ЦМВ И на гибель диплоидных фибробластов человека.
6.1. Динамика гибели фибробластов человека, инфицированных в различных фазах клеточного цикла.
6.2. Экспрессия мРНК генов 2, и белка Вс12 в клетках, инфицированных ЦМВ в различных пролиферативных состояниях.
6.3. Активация каспазы3 и транслокация цитохрома С в цитоплазму зараженных клеток.
6.4. Влияние ЦМВ на целостность цитоскелета клетки.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поздние транскрипты разделены на две подгруппы у1 и у2. При наличии I, Е и белков происходит сборка вирионов и выход частиц из клетки. Экспрессия сверхранних генов. Функциональная активность сверхранних белков. Экспрессия I генов ЦМВ инициируется в течение 1го часа после проникновения вируса в клетку, и этот процесс требует синтеза белков v и происходит с участием клеточной РНКполимеразы II. Установлено, что активаторами транскрипции I генов являются структурные вирусные белки, локализованные в тегументе. К ним относятся главный мембранный белок рр , , а так же I и 1. На первом этапе транскрибируются сверхранние I гены, которые включают в себя мажорные I I 23 гены и вспомогательные гены, , I11, и 3. Е гены кодируют неструктурные белки, необходимые для последующей экспрессии вирусных генов и действующие как трансактиваторы для других генов, так и автостимуляторы для собственных генов. Дополнительно эти белки регулируют экспрессию большого числа клеточных генов, воздействуя на физиологию клеткихозяина . К этим белкам относятся I1 р I и I2 3. Е1р является трансактиватором генов ряда ранних белков ЦМВ, которые в дальнейшем участвуют в репликационных процессах 6. Е1р так же участвует в регуляции клеточного цикла инфицированных клеток. Е1р обладает киназной активностью и способен фосфорилировать белки семейства ретинобластомы i и i, разрушая их связь с факторами транскрипции 2 . Известно, что р7 2 комплекс регулирует переход из в фазу. Вследствие связывания 1Е1р с р7 происходит подавление i опосредованного ингибирования промоторов, таких генов, как дигидрофолат редуктаза и ДНК полимераза а, которые контролируются 2 факторами 6. В результате 1Е1р индуцирует вступление клеток в фазу 1. Е2р белок, подобно белку 1Е1р, необходим для репликации ЦМВ и является трансактиватором ряда вирусных ранних генов 4. Это подтверждается данными, свидетельствующими о неспособности к полноценной репликации мутантного ЦМВ с делецией гена 1Е2р . ГЕ2р специфически взаимодействует с белком ретинобластомы и вследствие этого повышает транскрипционную активность 2 факторов 1. В результате 1Е2р индуцирует экспрессию ряда 2 зависимых генов, включая факторы, участвующие в репликации ДНК. При изучении действия 1Е2р на клеточный цикл установлено, что 1Е2р индуцирует вступление клеток в 8 фазу 9. Участие 1Е2р в регуляции пролиферации связано с его способностью трансактивировать промотор циклина Е и индуцировать активность Е2Р факторов 5. Другой механизм может быть связан с взаимодействием 1Е2р с белками р и р2П. При этом 1Е2р подавляет способность р и р и задерживает прохождение клеточного цикла. Е1р и 1Е2р так же участвуют в регуляции процессов апоптоза. Детально влияние 1Е белков на гибель клеток рассматривается в главе II. Там же рассматриваются функции двух других 1Е белков, кодируемых генами рЕ1Ь и рЦЬ , которые являются вирусными ингибиторами апоптоза. Во время сверхранней фазы репликации ЦМВ экспрессируются гены, относящиеся к семейству 2 и кодирующие трансактиваторы ТК и . Эти белки обнаруживаются как в ядре, так и в цитоплазме инфицированных клеток. ТК и 1К совместно с 1Е1 и 1Е2 участвуют в трансактивации р генов вируса и влияют на активности ряда клеточных генов 0 0. Е2а и активацию 1Ыазе Ь, белков системы интерферона, тем самым препятствуя созданию антивирусного состояния в клетке . Экспрессия ранних генов и их продуктов. Функции ранних белков. Экспрессия Е, или р генов, зависит от наличия 1Е белков. Е гены условно разделяются на два субкласса ранние Е р1 и раннепоздние ЕЬ. Транскрипция р1Е генов начинается через 48 часа после проникновения вируса, а р2Е Ь через 8 часа. В настоящее время известно более двух десятков ранних генов. Они играют существенную роль в репликации вируса, являются трансактиваторами как вирусных, так и клеточных генов и участвуют в предотвращении антивирусного действия клетки.