Термостабильная лихеназа Clostridium thermocellum для фундаментальных и прикладных исследований

• Автор: Комахин, Роман Александрович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ЛИХЕНАЗА ii

КАК ПРЕДСТАВИТЕЛЬ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗ СВОЙСТВА И СТРУКТУРА.

ГЛАВА 2. ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ В ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПРИКЛАДНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

2.1. Современные направления белковой инженерии рациональный дизайн и направленная

эволюция ферментов и белков

2.2. Изучение молекулярных основ тсрмостабилыюсти и фоллинга белков с использованием ферментов

термофильных организмов

2.3. Термостабильные гликозилгидролазы в

прикладных исследованиях.

2.4. Заключение
ГЛАВА 3. РЕПОРТЕРНЫЕ СИСТЕМЫ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ АСПЕКТОВ РЕГУЛЯЦИИ
ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
3.1. Основа методологии репортерных систем.
3.2. В каких исследованиях используют ренортерные
системы.
3.2.1. Изучение активности и индуцибельности промоторов и регуляторных элементов
транскрипционныерепортеры.
3.2.2. Поиск новых промоторов и регуляторных элементов
3.2.3. Определение локализации продуктов исследуемых генов трансляционные репортеры
3.2.4. Система доставки генов или продуктов
генов к клеткаммишеням. Генотерапин
3.3. Основные репортерные системы
преимущества и недостатки.
3.3.1. глюкуронидаза .i.
3.3.2. Зеленый флуоресцентный белок
i vii
З.З.2.1. подобные белки.
3.3.3. Термостабильная лихеназа i .
3.4. Заключение.
ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Глава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.
5.1. Термостабильная лихеназа как транскрипционный репортер в оригинальной дрожжевой векторной системе для
изучения регуляторных функций некодирующих
последовательностей геномов эукариот
5.2. Термостабильная лихеназа как
трансляционный репортер.
5.2.1. Лихеназа как трансляционный репортер для
белка Е. со И.
5.2.2. Лихеназа как трансляционный репортер
для белка СгуЗА .iii
5.3. Термостабильная лихеназа как репортерный
белокноситель для случайных и антигенных пептидов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
л
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Изучением ферментов целлюлолитического комплекса С. В Израиле в Вейцмановском институте и в Биотехнологическом центре ТельАвивского Университета, во Франции в Институте им. Пастера, в Германии в Институте Микробиологии Мюнхенского технологического университета, в Англии в Институте животноводства Кембридж. В России эти работы были начаты в начале х годов под руководством профессора Э. С. Пирузян со штаммом Ф7 С. Институте молекулярной генетики РАН и в лаборатории функциональной геномики Института общей генетики РАН Пирузян и др. Пирузян и др. i В. К. . . Голденкова, . Актуальность темы диссертационной работы. В последние годы уделяется много внимания использованию термостабильных ферментов, особенно гликознлгидролаз, в биотехнологии. Ранее в нашей лаборатории был клонирован ген, кодирующий термостабильную Р1,31,4глюканазу лихеназу С. Ген термостабильной лихеназы транзиентно и стабильно экспрессируется в клетках бактерий, цианобактерий, дрожжей, растений и млекопитающих с образованием активного и термостабильного фермента, а уровень экспрессии бактериального гена лихеназы зависит от регуляторного элемента, контролирующего его экспрессию. Активность тсрмостабильной лихеназы может быть определена простыми, быстрыми, чувствительными качественными и количественными методами, которые не требуют дорогостоящего оборудования и реактивов. Поэтому изучение структуры и свойств тсрмостабильной лихеназы, модификация ее последовательности, а также конструирование на ее основе гибридных белков и белковносителей являются перспективными направлениями исследований. V, в клетках низших эукариот дрожжах vii. За и сгуЗаЫ i iii, а также гесА и . ЕвРР, встроена в последовательности модифицированных и циклически перестановленных вариантов лихеназы как внутренний гетерологичный модуль фермента провести сравнительный анализ биохимических свойств гибридных белков. ГЛАВА 1. Термостабильная лихеназа i КФ 3. С. и гидролизует эндор1,4гликозидные связи в полиглюканах со смешанными р1,31,4гликозидными связями Зверлов, рис. Рис. Сайт гидролиза рглюканов лихеназой ЬсВ. Голденкова, а. Рис. Схематическое изображение структуры лихеназы. Ь8 лазерный сигнал, ПроТре пролинтреониновая последовательность, оскегт модуль целлюлосомосвязывающий модуль, стрелками показаны прямые повторы. Лидерная последовательность обеспечивает котрансляционный транспорт лихеназы в межклеточное пространство. Каталитический модуль ответственен за рсализацшо ферментативной активности. ПроТрспоследовательность является гибким линкером, который обычно соединяет структурно независимые домены. Цсллюлосомосвязывающий модуль i содержит два консервативных прямых повтора по а. Подобные модули встречаются у всех целлюлосомных белков чаще на Сконце . Механизм катализа, осуществляемый термостабилыюй лихеназой . Согласно современным представлениям, действие данного механизма осуществляется по схеме данной на рис. , . Рис. Удерживающий механизм гидролиза гликозидиых связей. Нуклеофильное основание находится в тесном соседстве с сахарным аномерным углеродом. Катализ протекает в два этапа и включает механизм перестановки групп ОН и Н через промежуточный гликозидферментный комплекс рис. . относится к семейству клана В. Ее вторичная структура рис. i i i i. В. , , В. В. x, В. vi и ряда других , , в том числе термостабильных, представлена преимущественно Голденкова, а. Соп XVVIV Ш1ШВ1в1аШМПвэпт19. ПяааШтПв. V. VV. I прслсниши вторичная етрутурв АЛ последомттояьмостъ i Рис. Проведенное компьютерное моделирование трехмерных структур некоторых лихеназ с помощью интерактивной биоинформационной системы i . .