Создание рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита и изучение их свойств

• Автор: Николенко, Галина Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 132 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА.

1. Структура и свойства иммуноглобулинов.

2. Организация генов иммуноглобулинов.

3. Рекомбинантные антитела.

3.1. Химерные антитела.

3.2. Гуманизированные антитела.

3.3. и vфрагменты антител.

3.4. Одноцепочечные антитела v.

3.5. Гибридные молекулы рекомбинантных антител.

3.6. Изолированный Vдомен.

3.7. Производные гипервариабельных петель.
4. Получение рекомбинантных антител i vi.
4.1. Продукция фрагментов антител в клетках .i.
4.2. Комбинаторные библиотеки генов иммуноглобулинов.
4.3. Экспрессия генов антител в клетках млекопитающих.
5. Перспективы применения рекомбинантных антител.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Конструирование гена одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита.
1.1 Клонирование генов вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей МКА Е6В.
1.2. Анализ первичной структуры V и V генов МКА Е6В.
1.3. Конструирование гена одноцепочечного антитела v.
2. Получение и исследование мономерных одноцепочечных антител.
2.1. Конструирование плазмиды, обеспечивающей продукцию в клетках .i мономерных рекомбинантных антител.
2.2. Исследование особенностей продукции мономерных одноцепочечных антител в клетках . i.
2.3. Оценка иммунохимических свойств мономерных рекомбинантных антител в составе клеточных лизатов.
3. Получение и исследование димерных одноцепочечных антител.
3.1. Конструирование плазмиды, обеспечивающей продукцию в клетках .i димерных рекомбинантных антител.
3.2. Исследование особенностей продукции димерных одноцепочечных антител в клетках . i.
4. Очистка рекомбинантных антител против вируса КЗ.
4.1 Конструирование плазмид, обеспечивающих продукцию мономерной и димерной форм одноцепочечных антител с гистидиновым гексамером на Сконце.
4.2. Очистка рекомбинантных антител на никелевом сорбенте.
5. Исследование иммунохимичсских свойств очищенных мономерных и димерных рекомбинантных антител.
6. Определение констант диссоциации комплекса антигенантитело для рекомбинантных антител и МКА Е6Б.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
I1ИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АИА антиидиотипические антитела
а.о. аминокислотные остатки
МКА моноклональные антитела
ИФА иммуноферментный анализ
оптические единицы
ПААГ полиакриламидный гель
КЭ клещевой энцефалит
ИПТГ изопропилрОтиогалактопиранозид
Ар ампициллин
I участок инициации репликации
гипервариабельный участок вариабельного домена антитела
антиген поверхностный антиген вируса гепатита В
эпитоп основной нейтрализующий эпитоп антигена
IV вирус иммунодефицита человека
каркасный участок вариабельного домена антитела
полимеразная цепная реакция
пектатлиаза В
v одноцепочечные антитела
V вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина V вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Показана специфичность взаимодействия полученных рекомбинантных антител с вирусом КЭ и рекомбинантным белком Е вируса КЭ, и подтверждена идентичность эпитопа белка Е, распознаваемого рекомбинантными антителами и МКА Е6В. Показано, что мономерные одноцепочечные антитела имеют аффинность примерно в 5 раз ниже, чем МКА Е6В, в то время как димерные одноцепочечные антитела уступают в аффинности исходным МКА примерно в 2 раза. Таким образом, иммунохимические характеристики полученных рекомбинантных антител свидетельствуют о том, что они близки по своим иммунохимическим свойствам исходным МКА. Сконструированные в результате работы векторные плазмиды, обеспечивающие эффективную продукцию рекомбинантных антител, могут быть использованы для получения и селекции рекомбинантных антител различной специфичности. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. РЕКОМБИНАНТНЫЕ АНТИТЕЛА. Структура и свойства молекул иммуноглобулинов. Антитела или иммуноглобулины это белки, продуцируемые лимфоцитами позвоночных в ответ на вторжение в организм чужеродной макромолекулы антигена. Они выполняют функции распознавания и связывания антигена, а также эффекторные функции в зависимости от принадлежности антител к тому или иному классу или подклассу, например, связывание с поверхностными Бсрецепторами клеток, фиксация комплемента и т. Белки, имеющие общие структурные особенности антител, чьи антигенсвязывающие свойства не установлены, называют иммуноглобулинами. Иммуноглобулины это симметричные молекулы, которые состоят из двух идентичных гликозилированных тяжелых Н цепей и двух идентичных легких Ь цепей. Тяжелые и легкие цепи связаны между собой дисульфидными мостиками, расположенными на Сконце СН1домена и СкСАбдомена, две тяжелые цепи также соединены одной или более дисульфидной связью, формируя единую белковую молекулу рис. Тяжелые цепи иммуноглобулинов представлены пятью изотипическими формами р, 5, у, 8, а, и в зависимости от этого иммуноглобулины разделяют на классы М, , , А. Легкие цепи иммуноглобулинов представлены двумя изотипическими формами ки1, поэтому каждый класс иммуноглобулинов представлен двумя типами молекул 1Ск, 1Мк, МА, и т. Гаковы основные общие принципы классификации иммуноглобулинов. В будущем, повидимому, детали будут изменяться в силу накопления новых данных о структуре иммуноглобулинов различных животных 1. Рис. А. Схематическое представление молекулы О. Каждая цепь состоит из ряда гомологичных единиц примерно из 0 а. Сайты протеолитического расщепления расположены между гомологичными единицами. Мембранная форма содержит гидрофобныйСконцевой компонент 8. Б. Компьютерная модель Тяжелые цепи окрашены в светлый цвет, легкие в темный. Углеводы, связанные с Сн2 черные. Как легкая, так и тяжелая цени молекул иммуноглобулинов состоят из ряда гомологичных единиц, каждая из которых включает в себя примерно по 0 аминокислот. При помощи кристаллографического анализа ряда антител установлено, что каждая гомологичная единица формирует домен, представляющий собой компактную глобулярную структуру, состоящую из двух слоев, расположенных напротив друг друга и соединенных между собой мостиком рис. Обе поверхности слоев образованы пептидными цепями с антипараллельной Рскладчатой структурой, стабилизированными водородными связями 2,3,4. Анализ аминокислотных последовательностей ряда иммуноглобулинов позволил выяснить, что концсвые участки как легких, так и тяжелых цепей довольно разнообразны, в то время как остальные относительно неизменны. Таким образом, были выделены вариабельные домены легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов V, V, константный домен легкой цепи , и константные домены тяжелой цепи I, СН2, СНЗ, а также шарнирный участок, расположенный между СН1 и СН2 в I его обозначают как отдельный домен. При сравнении аминокислотных последовательностей ряда иммуноглобулинов было обнаружено, что отдельные участки вариабельных областей отличаются особым разнообразием и строго локализованы, образуя гипервариабельные сегменты i i, , в то время как пептидные последовательности между гипервариабельными областями относительно консервативны и называются каркасными , областями 5.