Бифункциональные репортерные системы для про- и эукариот на основе делеционного варианта термостабильной лихеназы Clostridium thermocellum

• Автор: Мусийчук, Константин Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 102 с.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 ПОДХОДЫ К ИЗУЧЕНИЮ РЕГУЛЯЦИИ

ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ

2. РЕИОРТЕРНЫЕ СИСТЕМЫ

2.1. Основа методологии использования

репортерных генов

2.2. Требования, предъявляемые к репортерным генам

2.3. Хлорамфеникол ацетилтрансфераза .i

2.4. Бактериальные люциферазы V.vi и V.i

и люцифераза из светлячка i i x.

2.5. галактозидаза .i
2.6. глюкуронидаза .i
2.7. Зеленый флуоресцентный белок i vii
2.8. Репортерная система i
2.9. Недостатки используемых репортерных генов
3. ГЛИКОЗИЛГИДРОЛАЗЫ
3.1. Классификация Огликозилгидролаз
3.2. Механизмы гидролиза гликозидных связей
3.3. Целлюлосомная организация цсллюлолитических
ферментов
ГЛАВАII. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Анализ структуры лихеназы i ii
2. Получение дслеционного варианта лихеназы С.
и сравнительное изучение его биохимических свойств
3. Индуцибельная экспрессия гена сВМ2 в клетках ii i
4. Конститутивная и индуцибельная экспрессия сВМ
в клетках дрожжей
5. Экспрессия гена сВМ2 в клетках млекопитающих
6. Получение бифункциональных белков
6.1. Слияние последовательности гена сВМ2 с последовательностью
гена 3глюкуронидазы .i
6.2. Слияние последовательности гена сВМ2 с
последовательностью гена .vii
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Наиболее распространенные и используемые репортерньте системы это для клеток бактерий и млекопитающих, для растений, и зеленый флуоресцентный белок для большинства организмов. Для и имеются субстраты, позволяющие проводить точное определение активности и гистохимическое окрашивание тканей. Главная особенность это возможность следить за экспрессией гена i viv без разрушения клето и без использования субстратов. Однако все существующие репортерные системы, наряду с достоинствами, имеют и недостатки. Так, теряет активность при достройках в концевой области, в некоторых организмах обнаружена эндогенная не активна, фермент имеет длительный период полужизни для созревания необходимы поспрансляционные модификации и высокий уровень экспрессии, затруднено количественное тестирование флуоресценции белка. Поэтому поиск и разработка новых или улучшение старых репортерных систем актуальное направление исследований. Ранее была предложена новая репортерная система для растений ii . i. Этот фермент имеет широкий диапазон оптимума , температурный оптимум Топт. С, период полужизни при Топт. Представленная работа направлена на расширение круга организмов, в которых возможно использование репортерной системы i, а также на получение бифункциональной репортерной системы i, объединяющей преимущества двух репортерных белков, а именно количественные методы тестирования активности i и возможность слежения за экспрессией i viv . Цель исследования показать возможность использования репортерной системы 1лсВ для бактерий, дрожжей и млекопитающих, и создать бифункциональные репортерные белки, объединяющие преимущества двух репортерных белков 1лсВ и вРР. Провести модификацию последовательности гена НсВ и провести сравнительный анализ основных биохимических свойств модифицированных белков. Сконструировать экспрессионные векторы, в которых модифицированный ген сВМ2 находится под контролем различных регуляторных элементов, для трансформации клеток про и эукариот, и проанализирован экспрессию гена гсВМ2 в клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих. Создать бифункциональные репортерные белки ЫсВМ2ОРР и СРРУсВМ2. Сконструировать экспрессионные вектора, в которых последовательности, кодирующие бифункциональные белки, находятся под контролем различных регуляторных элементов, для трансформации клеток про и эукариот, и проанализировать экспрессию слитых генов в клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих. ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. I. Подходы к нзучепию регуляции экспрессии генов. В процессе роста организм проходит различные стадии развития и диффсренцировки, в результате которых из единственной клетки формируется взрослый организм, имеющий различные органы и ткани, которые отличаются по строению, физиологобиохимическим характеристикам, выполняемым функциям, по реакции на внешние или внутренние факторы. Все это многообразие объясняется наличием множества генов, которые экспрессируются постоянно, в определенный момент развития или в ответ на воздействие окружающей среды. Таким образом, для обеспечения всего многообразия реакций клетке необходима система регуляция экспрессии генов, которая позволила бы определенному гену экспрессироваться в определенный момент времени и в определенном органе, ткани или клетке организма. Регуляция экспрессии генов сложный, многокомпонентный процесс. Экспрессия гена может зависеть от его положения в геноме. Геномная ДНК эукариот имеет огромный размер порядка млрд. Имея такие большие геномы, последовательноегь Д1I должна уместиться в ограниченном объеме ядра. Например, геномная ДНК млекопитающих, имеющая размер 0 см должна разместиться в ядре с диаметром 5 мкм . Компактность ДНК достигается ее упаковкой в хроматин. Основная структурная единица хроматина нуклеосома, которая состоит из 6 п. Н2а, 2, НЗ, и Н4. Эта. ДНК . Смысл упаковки ДНК не только в компактности, но и в обеспечении регуляции экспрессии генов.