Получение бактериального суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы C(RACK1) с помощью генетической селекции сайта инициации трансляции

• Автор: Желябовская, Ольга Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Введение.
Глава I. Рекомбинантные белки как инструмент для изучения внутри клеточной сигнализации на примере белка 1ЪСК1.Обзор литературы.

1.1. Введение.

1.2. Белок 1 участник фосфоинозитидного пути передачи сигнала.

Фосфоинозитидный путь передачи сигнала.

Протеин киназа С и ее внутриклеточные рецепторы.

1 рецептор активированной протеинкиназы С.

1.3. Экспрессия чужеродных белков в .i.

1.3.1. Генетичсские элементы экспрессирующего вектора.

Промоторы.

Решающая роль инициации в эффективности процесса трансляции.

Закономерности первичной структуры области инициации трансляции.
Влияние вторичной структуры на эффективность инициации трансляции.
Применение сильных природных в генноинженерных конструкциях.
Усилители трансляции.
Терминаторы трансляции.
Стабилизаторы мРНК.
Использование кодонов.
1.3.2. Компартментализация продуцируемого белка.
1.3.3. Экспрессия правильно сворачивающихся белков в . i.
1.3.4. Химерные белки.
1.4. Рандомизация и генетическая селекция как инструмент молекулярной биологии.
Глава II. Получение бактериального суперпродуцента. рецептора активированной протеинкиназы С 1 с помощью генетической селекции сайта инициации
трансляции.Результаты и обсуждение.
2.1. Принцип и дизайн системы генетической селекции.
2.2. Конструирование и клонирование синтетического фрагмента в плазмидном
векторе .
2.3. Клонирование кодирующей части гена резистентности к тетрациклину в плазмиду 2.
2.4. Схема введения рандомизованного фрагмента.
2.5. Проведение генетической селекции в одноцистроиной системе.
2.6. Клонирование кДНК 1 в плазмиду 2.
2.7. Тестирование полученного сайта инициации трансляции для одноцистроиной системы в двуцистронной конструкции, содержащей гаск.
2.8. Контрольная конструкция для экспрессии 1 в двуцистронной системе.
2.9. Введение рандомизованного фрагмента в двуцистронную конструкцию 1.
2 Искусственный отбор и анализ отдельных клонов.
2 Тестирование области инициации трансляции из клонасупсрпродуцснта в исходном векторе 2.
Глава III. Материалы и методы.
3.1. Реактивы.
3.2. Ферменты.
3.3 Материалы.
3.4. Препараты.
3.5. Олигонуклеотиды.
3.6. Штаммы и векторы.
3.7. Лабораторное оборудование.
3.8. Буферы и растворы.
3.9. Методы.
Электрофорез нуклеиновых кислот в неденатурирующем ПААГ. Трансформация бактериальных клегок и отбор рекомбинантов. Препаративное выделение и плазмидной ДНК методом щелочного лизиса и очистка на ионообменных колонках ii 0.
Приготовление лизатов клеток для белкового электрофореза.
Белковый электрофорез.
Амплификация ДНК i vi.
Очистка продуктов амплификации.
Извлечение ДНК из агарозного геля.
Иммуноблотинг.
Клонирование синтетического дуплекса в составе плазмиды . Клонирование кодирующей последовательности гена устойчивости к тетрациклину в плазмиду 2.
Клонирование кодирующей последовательности гена рецептора активированной протеинкиназы С 1 в составе плазмиды 2. Введение рандомизованного олигонуклеотида в конструкцию .
Введение синтетического дуплекса в вектор . Введение синтетического дуплекса в конструкцию . Искусственный отбор.
Выводы.
Список литературы


Очистка продуктов амплификации. Извлечение ДНК из агарозного геля. Иммуноблотинг. Клонирование синтетического дуплекса в составе плазмиды . Клонирование кодирующей последовательности гена устойчивости к тетрациклину в плазмиду 2. Клонирование кодирующей последовательности гена рецептора активированной протеинкиназы С 1 в составе плазмиды 2. Введение рандомизованного олигонуклеотида в конструкцию . Введение синтетического дуплекса в вектор . Введение синтетического дуплекса в конструкцию . Искусственный отбор. Выводы. Список литературы. Список сокращений. БисА А М. Введение. Совершенствование методологии рекомбинантных ДНК поразительно расширило возможности направленного биосинтеза белка. Среди различных систем экспрессии генетических детерминант важное место занимают прокариотические системы. Бактериальные суперпродуценты позволяют получать значительные количества высокоочищенных рекомбинантных белков для использования в медикобиологических и сельскохозяйственных целях. Для экспрессии в бактериальной системе безинронный ген кДНК клонируют в плазмидный вектор, содержащий структурные элементы, необходимые для его транскрипции и трансляции. Наиболее эффективная и широко используемая система транскрипции система Студисра включает промотор из фага Т7 в сочетании с бактериальными штаммами, несущими индуцибсльный ген Т7РНКполимеразы в своем геноме i , . Эта система обеспечивает массивную транскрипцию, эффективность которой практически не зависит от структуры целевого гена. Однако, выход белка в одной и той же системе экспрессии может сильно варьировать от гена к гену. Этот факт объясняется тем, что лимитирующей в этих условиях является следующая стадии биосинтеза белка трансляция, в особенности ее инициация. Эта стадия является наименее предсказуемой, так как ее эффективность сильно зависит от структуры целевого гена, которая в большой степени определяет вторичную структуру участка связывания рибосом. В идеале сайт связывания рибосом нужно было бы подбирать специально для каждого целевого гена, однако рациональной основы для такого подбора не существует, так что обычно это делается методом проб и ошибок. В нашей работе, вместо рутинного перебора вариантов различных последовательностей, мы разработали комбинаторный подход при котором нужные последовательности выбираются автоматически в результате генетической селекции в специальной системе. Этот подход позволяет подобрать эффективный сайт инициации трансляции для любого чужеродного гена в одном эксперименте. Эта система была нами использована для создания суперпродуцента рецептора активированной протеинкиназы С ЯЛСК. Глава Рекомбинантные белки как инструмент для изучения внутриклеточной сигнализации на примере белка 1. Обзор литературы. Введение. Данная диссертационная работа посвящена экспрессии гена рецептора активированной протеинкиназы С в . Клетки ii i широко используются в качестве хозяина для эффективной продукции гетерологичных белков. Этот метод получения препаратов белков широко используется как в биотехнологии и медицине, так и в фундаментальных научных исследованиях. В научных исследованиях рекомбинантные белки обычно используют для изучения белокбелковых взаимодействий ш vi и выяснения пространственной структуры белков. В некоторых случаях для этого используют химерные белки, содержащие дополнительный домен, облегчающий их экспрессию и очистку, а также зачастую используемый в экспериментах по белокбелкому взаимодействию на афинном носителе. Однако, во многих случаях, особенно когда речь идет о пространственной структуре, стараются использовать рекомбинантные белки, максимально приближенные к природным. На основе плазмидных ДНК . Однако, несмотря на множество достоинств, эффективная экспрессия в . РНК и их белковых продуктов препятствуют разработке универсального метода экспрессии. Вторая часть литературного обзора посвящена современному состоянию проблемы прокариотической экспрессии чужеродных генов, уделяя особое внимание подходам к оптимизации выхода рекомбинантных белков.