Структурно-функциональная характеристика системы рестрикции-модификации ДНК CfrBI штамма Cirobacter freundii 4111

• Автор: Белецкая, Ирина Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 139 с.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Системы рестрикциимодификации.

1.1.1. Явление рестрикциимодификации.

1.1.2. Сайтспецнфнческис эндонуклеазы и ДНКметнлтрансферазы.

1.1.3. Распространение систем рестрикциимодификации

1.1.4. Молекулярная организация систем рестрикциимодификации.

1.1.5. Классификация ферментов системы рестрикциимодификации

1.1.6. Системы рестрикциимодификации I типа.

1.1.7. Системы рестрикциимодификации 1Я типа.

1.1.8. Системы рестрикциимодификации типа

1.1.9. Ферменты системы рестрикциимодификации III типа
1.1 Ферменты системы рестрикциимодификации IV типа
1.2. Непарные ДНКметилтрансферазы и эндонуклеазы рестрикции.
1.3. Метилирование ДНК в .i
1.3.1. зависимая регуляция генной экспрессии.
I.4. Метилирование ДНК эукариотических организмов
1.4.1. Метилирование и процессы развития.
1.4.1.1. Импринтииг
1.4.1.2. Инактивации хромосомы X.
1.4.2. Распределение в геноме человека.
1.4.3. Влияние метилирования ДНК на структуру хроматина
1.5. Регуляция экспрессии генов в системах РМ.
1.5.2. Регуляция экспрессии генов ii системы РМ из .
1.5.3. Регуляция экспрессии генов в системах РМ II типа.
1.5.4. Регуляция экспрессии генов РМ систем III типа
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
.1. Материалы
.1.1. Штаммы бактерий, бактериофаги, фаговые и плазмидные вектора
.1.2. Среды и основные буферы
.1.3. Материалы и реактивы.
.2. Методы исследования
.2.1. Выделение плазмнлной ДНК.
.2.1.1. Лизис щелочью
.2.1.2. Модифицированный метод лизис щелочью с последующей очисткой ДНК
.2.1.3. Лизис кипячением.
.2.1.4. Очистка плазмнлной ДНК равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия.
.2.2. Получение компетентных клеток Е. i и нх трансформация.
.2.3. Полимеразная цепная реакция ПЦР
П.2.4. Препаративное выделение фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы
.2.5. Препаративное выделение фрагментов ДНК из полиакриламидных гелей.
.2.6. Получение препаратов фагов Xvi и в высоком гитре.
.2.7. Выделение ДНК фагов Хс, Xvi и фvi
.2.8. Определение ферментативной активности и специфичности .I
.2.9. Определение точки разрезания фосфодиэфирной связи .1 на молекуле субстратной ДНК.
.2 Клонирование гена эндонуклеазы
.2 Клонирование гена ДНКмсгилтрансфсразы М
.2 Экспрессия генов эндонуклеазы i6.I и метилтрансферазы i.I
.2 Определение молекулярного веса белков I и .
.2 Определение оптимальных условий реакции для метилтрансферазы i6I.
П.2 Реакция метилирования i viv и i vi.
I2 Определение типа цигозннового метилирования, осуществляемое Ы.СгЫ.
II.2 Конструирование рекомбинантных плазмид с перекрывающимися уникальными сайгами
для определения позиции метилированного цитозина в последовательности сайга
П.2 Конструирование плазмид, производных , содержащих различные варианты промоторных областей генов I I
.2 Определение активности галактокиназы
.2 Определение связывания .X с промоторной областью гена I методом задержки в агарозном геле
.2 Транскрипция i vi.
.2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1.1. Характеристика генетической организации системы рестрикциимодификации
1.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей .I и .I с последовательностями других ферментов систем РМ
1.3. Определение сайта узнавания и места гидролиза фосфоднтфирной связи на молекулах
субстратной ДНК .I.
I.4. Определение типа метилирования цитозиновых остатков, осуществляемое .
1.5. Создание штаммовпродуцен тов с регулируемым уровнем экспрессии ферментов системы рестрикциимодификации
1.5.1. Клонирование н экспрессия гена I.
Ш.5.2. Клонирование и экспрессия гена I.
1.6. Очистка и определение оптимальных условий реакции для i6.I
1.7. Определение локализации метилированного основания в последовательности сайта
1.8. Исследование регуляции экспрессии генов в системе рестрикциимодификации СтВ
П1.8.1. Определение минимального района ДНК с функционально активным промотором гена I
1.8.2. Изучение регуляции генов I и I в системе i viv
1.8.3. Зависимость эффективности транскрипции с промоторов генов I и I от метилирования цитозинов в сайте , расположенного в промоторной зоне этих генов.
1.8.4. Транскрипция i vi с промоторов генов I и I
I.8.5. Новый способ регуляции генной активности систем
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
А аденин С цитозин гуанин Ттимин
5, 5, ,5 С5 мстилцитозин
4, , 4 4 метилцитозин
6, 6, 6 метиладснин
, ЗАденозилЬметионин
аденозин5трнфосфат
Трис трисгидроксимстиламинометан
ЭДТАЫагЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
ДТТ дитиотреигол
ДДС додецил сульфат натрия
п.п. пар нуклеотидов
т.п.н. тысяча нар нуклеотидов
ИПТГ изопропилтиорПгалактозид изопропилгалактопиранозид ПААГ полиакриламидный гель кДа килодальтон
X 5бром4хлор3индолилргалактозид
Фермент большой фрагмент .i ДНК полимеразы
ВВЕДЕНИЕ


Янулайтис с коллегами высказали предположение, что эндонуклеазы рестрикции должны содержаться практически в каждом штамме микроорганизмов Янулайгис и др. При этом они исходили из гипотезы о жизненной необходимости этих ферментов для бактериальных клеток. По их мнению, ЭР, помимо защиты бактерий от фагов, принимают непосредственное участие в генетических процессах например, сайтспецифичсской рекомбинации, регуляции активности генов и т. II типа в штаммах С. Специфическая активность была обнаружена в десяти штаммах, а при хроматографическом фракционировании бесклеточных экстрактов остальных штаммов, позволившему преодолеть маскирование рестриктазной активности неспецифическими нуклеазами, еще в пяти, хотя ферменты содержались в них и в следовых количествах. В цитируемой работе фактически впервые был высказан тезис, который довольно трудно опровергнуть эндонуклеазы систем РМ могут не поддаваться идентификации современными методами, а потому исключить их наличие в исследуемых штаммах бактерий нельзя даже при отрицательных результатах всех доступных тестов. РМ бактерий содержат эти системы, а остальные три четверти либо их не содержат, либо их нельзя обнаружить с помощью современных методов i, . Оказалось также, что каждый род микроорганизмов имеет свой характерный набор эндонуклеазных специфичностей и что в отношении количества специфичностей отдельные рода и виды представлены далеко неодинаково i, . Обшей чертой в молекулярной организации охарактеризованных систем РМ оказалось тесное сцепление генов МТ и ЭР, которые, в свою очередь, могут быть расположены во всех возможных вариантах, как в отношении их нуклеотидных последовательностей ДНК эндонуклеаза метилаза, метилаза эндонуклеаза, так и в их ориентации тандемная, конвергентная и дивергентная организации. Разнообразие организации генов систем РМ указывает на возможность разновариантного способа координации их экспрессии в разных системах рис. Поскольку основной функцией систем РМ является защита бактериальной клетки от проникновения чужеродной ДНК, то регуляция экспрессии их генов должна быть строго скоординирована. Близость в расположении двух генов облегчает возможность строгоскоординированной регуляции i . Для некоторых систем РМ показано, что гены ЭР и МТ отделены небольшой ОРС, кодирующей регуляторный белок Сбелок, который участвует в регуляции экспрессии генов этих систем Тао . Iv . Несмотря на то, что все системы РМ выполняют одинаковую биологическую функцию защиты клеткихозяина от проникновения чужеродной ДНК, пути их осуществления различны. Различия касаются структуры белков и потребности в кофакторах, симметричности последовательности узнавания и характера расщепления ДНК , . Для расщепления ДНК необходимо, но крайней мере, присутствие в реакционной смеси ионов 2 или сопоставимых ионов, а для модификации . В настоящее время все обнаруженные ЭР подразделяют на 4 класса I, II, III, IV , . I аминометилтрансферазы, включающие в себя класс т6АМТ 7метиладениновые и шСМТ Жметилцитозиновыс, ко II тину относятся пгСМТ 5метилцитозиновые i, , i , ii . РМ разделяют по классу ЭР, соответственно, на 4 типа . М системы I типа подразделяют на четыре семейства I, ГО, I, I в зависимости от порядка расположения генов системы от результатов комплементационного анализа субъединиц, входящих в состав РМ системы энзиматических свойств ферментов и от присутствия определенных консервативных аминокислотных последовательностей в белковых молекулах i i, , . Субъединицы, принадлежащие к одному семейству, являются взаимозаменяемыми, т. Расе, . Гены систем РМ I, I, I семейств локализованы на хромосоме . I кодируются большими коныюгагивными плазмидами i . Рис. Типы структурной организации генов систем рестрикциимодификации , II и III типов. Типы структурной организации генов системы рестрикциимодификации I типа ИсЯ, ЬсМ, кся гены, кодирующие Б, М и Я субъединицы, соответственно. Типы структурной организации генов системы РМ III типа. Типы структурной организации генов системы РМ II типа. I. тандемная организация генов ЭР МТ. II. МТ ЭР. III. IV. ЭР сайтспецифическая эндонуклеаза, МТ ДНКмстилтрансфсраза, С регуляторный белок.