Связывание когезина Saccharomyces cerevisiae с хроматином

• Автор: Каганский, Александр Маркович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 92 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биологическая роль когезии сестринских хроматид

2. Молекулярная природа когезии сестринских хроматид

2.1. Введение

2.2. Когезии структура комплекса и механизм действия

2.3. Дополнительные факторы когезии в митотическом цикле

2.4. Когезия в мейозе

3. Регуляция когезии при сегрегации хромосом
4. Структура сайтов когезии
5. Открытые вопросы в когезии МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Ж 1. Стандартные методы
2. Манипуляции с клетками дрожжей
3. Антитела
4. Очистка рекомбинантных белков
5. Метод торможения фрагментов ДНК в геле ретардация
6. Сборка хроматина i vi
7. Экспсриме1гты по связыванию когезина с хроматином
8. Прочие эксперименты i vi РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Функциональная характеризация когезина
1.1. Исследование структуры сайтов когезии i viv
1.2. Взаимодействие когезина с ДНК и хроматином i vi
1.3. Исследование вклада составляющих когезина в установление когезии
2. Исследование структурнофункциональных взаимоотношений белков, участвующих в когезии сестринских хроматид
2.1. Сайтнаправлснный мутагенез белка
2.2. Изучение роли белка Рс15р в когезии
2.3. Изучение роли белка Есо1р в когезии 3. Мейотичсский вариант когезина ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Благодарности
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Для воспроизведения точных копий своего генома, в процессе митоза или мейоза, клетке необходимо правильным образом разделить каждую редуплицировавшуюся хромосому на две хроматиды, чтобы дочерняя клетка получила одну из них. Недостаток или избыток числа хроматид приводит, соответственно, к гибели или дестабилизации генома. Так, человеческие эмбрионы с неправильным хромосомным набором в большинстве случаев погибают, а в случае их выживания приводят к серьезным дефектам у новорожденных. Подобные же нарушения в клетках взрослого человека часто являются причиной злокачественных новообразований i . История изучения процесса, получившего название когезия сестринских хроматид насчитывает немногим более пяти лет, когда было доказано, что хроматиды остаются сцепленными друг с другом при помощи специализированного белкового комлекса, когезина, с момента их синтеза до расхождения. Именно механизм когезии лежит в основе хорошо известного по данным микроскопии распределения хромосом в центре митотического веретена и последующего одновременного расхождения хромосом к противоположным полюсам . . Установление когезии происходит строго во время репликации и непосредственным образом зависит от формирования когезина, состоящего из четырех субъединиц 3 и 31,2 . . . Данные, полученные к настоящему момещу, свидетельствуют о том, что образовавшиеся при этом хроматиды могут удерживаться вместе либо за счет ДНКсвязывающсй активности когезина v . i , либо за счет удержания хроматид внутри кольца, образуемого субъединицами когезина i . Хотя главная функция когезина состоит в обеспечении правильной сегрегации хромосом, он, повидимому, принимает участие в других важных процессах в клетке и играет роль в структурной организации хроматина. Кроме того, он принимает участие в ответе клетки на повреждение ДНК i . i . i . i . . . . Iii . При этом, в силу того, что когезии был до сих пор практически не охарактеризован с точки зрения его ферментативной активности, остается неизвестным, заложена ли многофункциональность когезина в его способности скреплять хроматиды, или же у данного комплекса много различных молекулярных функций. Хотя центральная роль в обеспечении когезии сестринских хроматид отводится когезину, этот процесс зависит от ряда других белковых факторов, многие из которых остается к настоящему моменту плохо изученными. К их числу относятся белки 5 и , роль которых в когезии, а также взаимоотношения с когезином, до сих пор не известны. В настоящий момент молекулярный механизм установления когезии практически не изучен. Центральным вопросом здесь является то, каким образом когезии физически взаимодействует с хромосомой, а также, чем обусловлена пространственная и временная специфичность этого взаимодействия i viv. Принимая во внимание тот факт, что когезин связывается с хромосомами в локусах с различной структурой, включая такие как эу и гетерохроматин, це Представленная работа посвящена исследованию молекулярных механизмов когезии сестринских хроматид в различных условиях. Главной целью данного исследования было выделить четырсхсубъединичный когезин из . Задачи исследования Цслыо данного исследования было выделение четырсхсубъединичного когезина из vii и установление его субстратной специфичности. Определить особенности связывания когезина с хромосомами . Клонировать, экспрессировать и очистить рекомбинантный когезин . Охарактеризовать Д 1Ксвязывающую активность когезина i vi. Охарактеризовать хроматинсвязывающую активность когезина i vi. Определить факторы, влияющие на взаимодействие когезина с хроматином i vi. Активный рекомбинантный комплекс когезин дрожжей . Взаимодействие рекомбинантного когезина хроматином i vi является специфическим и характеризуется высокой аффинностью. Взаимодействие когезина с хроматином происходит не через хвостовые домены гистонов и не через межнуклсосомную линкерную ДНК.