Получение и исследование лактоферрина человека, синтезируемого с молоком трансгенных мышей

• Автор: Дейкин, Алексей Васильевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 121 с. : ил.

Оглавление
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Трансгенные животные. Способы получения и использования
1.2. Лактоферрин. Структура и функции
1.3. Перспективы и актуальность темы диссертации
2. Материалы и методы исследований
2.1. Материалы
2.2. Методы
3. Результаты и обсуждение
3.1. Получение первичных трансгенных мышей
3.2. Тканеспецифичность экспрессии трансгена
3.3. Передача трансгена в ряду поколений трансгенных мышей
3.4. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком первичных трансгенных самок и дочерей от первичных трансгенных самцов мыши
3.5. Животные с необычно высоким уровнем продукции рекомбинантного лактоферрина человека с молоком
3.6. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека в поколениях трансгенных по гену лактоферрина человека мышей в зависимости от линии, конструкции, копийности встроившегося трансгена
3.7. Продукция рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных самок мыши в течение периода лактации
3.8. Физико-химические и биологические свойства рекомбинантного лактоферрина человека из молока трансгенных мышей
3.9. Патоморфологический и гистологический анализ трансгенных мышей
Выводы
Список литературы

Введение
В современной медицине большое внимание уделяется биологически активным белкам человека как лекарственным средствам. Такие белки высокоэффективны и биологически безопасны. К их числу относятся различные гормоны, ферменты, факторы свёртываемости крови, роста тканей и др. Существенным препятствием на пути развития новой области фармацевтики является практическая невозможность получения необходимых белков из жидкостей и тканей самого человека в промышленных масштабах. В связи с этим в последние десятилетия для получения лекарственных белков человека использовались биотехнологические методы, главным образом, микробный синтез. В качестве продуцентов лекарственных белков человека также используют водоросли, высшие растения, грибы. Таким путём были получены инсулин, интерфероны, некоторые факторы свёртываемости крови и ряд иммуномодуляторов. К сожалению, ни одна из этих биотехнологических систем не смогла в полной мере обеспечить идентичность рекомбинантных белков человека природным, в частности, необходимые посттрансляционные модификации структуры белка. Крайне сложным оказался процесс очистки таких рекомбинантных белков. Их применение нередко сопровождалось аллергическими реакциями у пациентов. Кроме того, такое производство лекарственных белков человека оказалось экологически проблемным. В ряде стран оно постепенно выводится из хозяйственного обращения. Проблему получения рекомбинантных белков человека пытаются решить с использованием культивируемых соматических клеток, однако этот путь длителен и дорогостоящ.
В связи с этим возникла идея использовать в качестве биореакторов
лекарственных белков человека трансгенных сельскохозяйственных
животных, в частности, продуцирующих эти белки с молоком. Исследования
в этом направлении широким фронтом ведутся в ряде индустриально
развитых стран. В разработке находятся более 50 лекарственных белков

человека, для одних из которых получены трансгенные животные, для других проводятся доклинические или клинические испытания.
Несмотря на отдельные практические достижения, проблема получения лекарственных белков человека с использованием трансгенных животных нуждается в глубокой научной проработке. В числе её актуальных вопросов находится генное конструирование, технология получения трансгенных животных, обеспечение экспрессии генов интереса и передача этого признака в ряду поколений, получение промышленных стад животных-продуцентов.
Цель работы:
Получение и исследование ключевого белка человека, обеспечивающего антибактериальную защиту детей раннего возраста - лактоферрина из молока трансгенных мышей, выбор оптимальных генных конструкций, обеспечивающих максимальную продукцию полноценного лактоферрина человека с молоком трансгенных животных и передачу рекомбинантного гена последующим поколениям при сохранении здоровья животных-продуцентов.
Задачи:
1. Получить первичных трансгенных по различным конструкциям с геном лактоферрина человека мышей.
2. Выбрать генную конструкцию, обеспечивающую наибольшую продукцию рекомбинантного лактоферрина человека с молоком трансгенных мышей.
3. Проследить передачу трансгена в ряду поколений животных.
4. Определить динамику продукции рекомбинантного лактоферрина человека на протяжении периода лактации.
5. Определить соответствие рекомбинантного лактоферрина человека природному по физико-химическим и биологическим свойствам.
6. Определить влияние трансгена лактоферрина человека на состояние здоровья трансгенных мышей.

1.2.4. Роль LTF в защитных реакциях организма против микробной инфекции
Преимущественная локализация LTF в секреторных выделениях косвенно указывала на то, что основная функция этой молекулы заключается в защите слизистой от экзопатогенов [163]. В дальнейшем было установлено, что LTF, который синтезируется и накапливается нейтрофилами, эффективно используется в защите организма от энтеральных инфекций. Антимикробные свойства LTF изучены в in vitro и in vivo экспериментах [166]. Показано, что способность этого белка подавлять широкий диапазон микробных агентов определяется несколькими молекулярными механизмами.
Одной из первых для молекулы LTF была экспериментально продемонстрирована бактериостатическая активность. Высокая аффинность к железу, а также то, что LTF синтезируется и секретируется преимущественно в свободной от металла форме (апоформе), приводит к активному связыванию этим белком свободных ионов железа из окружающей среды, что замедляет рост микроорганизмов [167].
В дальнейшем было установлено, что LTF обладает и прямой
бактерицидной активностью против бактерий, независимо от его
способности связывать железо [168]. В экспериментах in vitro Ellison с
коллегами [169] показали, что бактерицидная активность LTF определяется
его способностью связываться непосредственно с внешней мембраной грам-
отрицательных бактерий. Это приводит к быстрому освоболсдению
микробного липополисахарида и последующему разрушению мембраны, что
вызывает гибель микроорганизмов. Позже было высказано предположение,
что именно положительно заряженный концевой домен молекулы LTF
отвечает за бактерицидную активность этого белка. Этот домен, названный в
дальнейшем лактоферрицин, был выделен из нативного белка и, при
сравнительном анализе с интактным LTF, продемонстрировал более высокую
активность против целого ряда грам-положительных и грам-отрицательных
бактерий, а также вирусов, патогенных грибов и простейших [170]. Однако