Селекция ЛАК клетками белка Tag7 человека, клонирование и изучение соответствующего гена

• Автор: Миркина, Ирина Ильинична
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 146 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1 Основной принцип врожденного и приобретенного иммунного
ответа
2 Рецепторы, вовлеченные в неклональный иммунный ответ
2.1 Общая характеристика
2.2 Семейство Toll/IL-IR
3 Белковые факторы, продуцируемые в процессе иммунного ответа: сигналы опасности
3.1 Прямое цитолитическое действие на чужеродный антиген
3.2 Хемоаттракция (хемотаксис)
3.3 Стимуляция клональных Т- и В- лимфоцитов и
клеток врожденного иммунитета
4 Роль сигналов опасности в противоопухолевом иммунитете:
4.1 ЛАК клетки как in vitro модель для изучения противоопухолевого
иммунитета
4.2 Причины иммунологической толерантности организма в отношении
опухолей
4.3 Механизм повышения иммуногенности с помощью сигналов
опасности

5 Индукция программированной гибели клеток-мишеней, пораженных чужеродным антигеном:
5.1 Классификация механизмов клеточной гибели:
некроз и апоптоз
5.2 Основные признаки апоптоза
5.3 Основные механизмы трансдукции апоптотического сигнала:
5.3.1 Роль адапторных молекул в апоптозе
5.3.2 Эффекторные молекулы: идентификация, пути активации и осуществления эффекторных функций в процессе апоптоза
5.4 Регуляция "апоптотической программы": ингибиторы и активаторы апоптоза и их значение для организма
ЗАКЛЮ ЧЕНИЕ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:
-Ферменты и реактивы
-Агарозный гелъ-электофорез ДНК
-Реакция обратной транскрипции и амплификация фрагментов кДНК
tag!
-Плазмидные и фаговые векторы
-Штаммы бактерий
-Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК
-Выделение плазмидной ДНК
- Определение первичной последовательности ДНК
-Выделение тотальной РНК
-Выделение хромосомной ДНК и приготовление образцов
хромосомной ДНК для Саузерн-блот-гибридизационного анализа
-Выделение фаговой ДНК
-Нозерн- и Саузерн- блот гибридизационный анализ
-Конструирование геномной человеческой библиотеки
-Приготовление бактериальных штаммов, определение
титра и амплификация библиотеки
-Скрининг библиотеки
-Клонирование, экспрессия и выделение рекомбинантного
интерлейкина
-Получение поликлональной антисыворотки к белку Tag7
-Очистка поликлональных Tag7-специфических антител
-Выделение и культивирование лейкоцитов периферической
крови и ЛАК клеток человека
-Культивирование трансформированных клеточных линий
-Определение цитолитической активности
-Изучение фрагментации ДНК клеток-мишеней
-Иммуногистохимический анализ
-Иммунофлуоресцентный анализ
Иммунопреципитация Tag?-подобного иммунореактивного белка из клеточных лизатов и кондиционной среды

которых- пролиферация, дифференцировка, остановка роста или клеточная гибель - зависит от пути трансдукции сигнала (28-30, 33, 38, 68, 70, 71, 75, 77-79). В настоящий момент идентифицирован целый спектр молекулярных участников процесса передачи сигнала при апоптозе и в ряде случаев установлена последовательность их активации.
Известно, что апоптоз, индуцированный FASL и TNF не блокируется ингибиторами РНК- и белкового синтеза (88, 89). Более того, была детектирована индукция апоптоза под действием моноклональных антител к FAS/APO-1 в клетках, лишенных ядра (90). Эти и другие данные свидетельствуют о том, что клетки-мишени располагают механизмом трансдукции апоптотического сигнала уже в собранном виде и сигнал, индуцированный взаимодействием лиганда с рецептором, просто запускает этот механизм.
На примере системы FAS и TNF было показано, что верхнее положение в цепи передачи сигнала занимают адапторные молекулы. В частности, было установлено, что активация посредством FASL-FAS/CD95 индуцирует транслокацию и связывание с цитоплазматической областью рецептора FAS адапторного белка FADD/ MORT1 (29, 38, 91-93). Взаимодействие FAS/ FADD опосредовано консервативной областью протяженностью приблизительно 80 аминокислот, известной как DD ( death domain, домен смерти) (29, 38, 91, 92). В то время как С- конец FADD/MORT1, содержащий DD, обуславливает связывание с рецептором