Количественный анализ анатоксинов на гидрогелевых биологических микрочипах

• Автор: Дюкова, Вероника Игорьевна
• Шифр специальности: 03.00.03, 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Бактериальные токсины.

1. 1. 1. Стафилококковый энтеротоксин В.

1. 1.2. Дифтерийный токсин

1. 1. 3. Столбнячный токсин.

1. 1.4. Сибиреязвенный токсин.

1. 2. Растительные токсины

1.2. 1.Рицин

1.2. 2. Вискумин

1.3. Методы обнаружения биотоксинов в окружающей среде

1. 4. Белковые микрочипы
1.4. 1. Двумерные белковые микрочипы для обнаружения биотоксинов
1.4. 2. Белковые микрочипы на основе гидрогелей.
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
2. 1. Белковые микрочипы.
2. 2. Белковый гидрогелевый микрочип для обнаружения биотоксинов
2. 3. Регистрация результатов иммуноанализа.
2.4. Исследование процессов, проходящих в объеме гелевой
2.5. Различные варианты иммуноанализа анатоксина рицина, проводимые на микрочипе
2.6. Иммуноанализ анатоксинов вискумина, стафилококкового энтеротоксина В, столбнячного токсина, дифтерийного токсина и летального фактора сибиреязвенного токсина
2.7. Прямой анализ анатоксина стафилококкового энтеротоксина В
с массспектрометрической регистрацией сигнала
2. 8. Параллельный анализ нескольких анатоксинов на микрочипах
2. 9. Стабильность микрочипов с иммобилизованными антителами
2 Гликопротеиновый микрочип.
. Выбор способа иммобилизации углеводов в гелевом
элементе микрочипа.
. Комбинированный гликопротеиновый микрочип для определения анатоксинов, обладающих углсводсвязывающей активностью на примере анатоксина рицина.
2 Оптимизация условий для проведения иммуноанализа на гелевых белковых микрочипах на примере прямого анализа анатоксина рицина
2 Определение констант ассоциации бинарного комплекса флуоресцентно меченного анатоксина с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами.
2 ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.
3.1. Приборы и реактивы
3.2. Получение анатоксинов и моноклональных антител против токсинов
3.3. Получение моноклональных антител против трисахаридов
групп крови
3.4. Изготовление белковых микрочипов
3.5. Методика получения конъюгатов антител с биотином
3.6. Методика получения конъюгатов антител с псроксидазой хрена
3.7. Окрашивание белков флуоресцентными красителями СуЗСу
3.8. Методики проведение анализов на микрочипах
3.8.1. Флуоресцентные и хемшиоминесцентные измерения.
3.8.2. Кинетические измерения на микрочипах
3.8.3. МА1ЛЛТОР масс спектральный анализ на микрочипс
3.8.4. Иммуноанализ анатоксинов на белковых микрочипах.
3.8.5. Прямой иммуноанализ анатоксинов на микрочипах.
3.8.6. Конкурентный иммуноанализ на микрочипах анатоксин рицина
3.8.7. Сэндвич иммуноанализ анатоксинов.
3.8.8. Одновременный анализ нескольких анатоксинов на
микрочипах.
3.8.9. Определение констант ассоциации Каи бинарного комплекса флуоресцентно меченного анатоксина с иммобилизованными на микрочипе моноклональными антителами.
3.9. Исследование при помощи флуоресцентного сканирующего конфокального микроскопа проникновения белков с различной молекулярной массой в гелевый элемент микрочипа на примере прямого и сэндвич анализа анатоксина рицина.
3 Определение степени иммобилизации белков антител и анатоксинов и сахаридов в геле.
3 Гликочины, содержащие иммобилизованные неогликоконъюгаты и спейсерированные трисахариды.
3 Твердофазный иммуноферментный анализ ЕЫБА культуральной жидкости, содержащей антитела против трисахарида А А на луночном планшете.
3 Анализ сыворотки третьей группы крови на гликочипах, содержащих иммобилизованный трисахарид А в спейсерированной форме.
3 Комбинированный гликопротенновый микрочип для определения анатоксинов, обладающих углеводсвязывающей активностью на примере
анатоксина рицина.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В настоящее время хорошо известны многие бактериальные, растительные и животные токсины, обладающие сильным токсическим действием на человеческий организм. К наиболее сильным относятся бактериальные токсины ботулинический и столбнячный токсины, токсины золотистого стафилококка, токсины растительного происхождения рицин, вискумин, токсины синезеленых водорослей, микотоксины и пр. Эти токсины могут попадать в организм не только в результате инфицирования, но и с пищей, водой, а также воздушнокапельным путем. Поэтому большое значение в настоящее время имеет разработка быстрых и чувствительных методов определения токсинов для проведения клинических анализов, проверки пищевых продуктов, экологического мониторинга. Для идентификации и анализа, как самих токсинов, так и организмов, которые их вырабатывают, в настоящее время используются различные лабораторные методы, включающие тесты на животных, микробиологические методы, анализ ДНК с использованием ПЦР, иммунологические методы радиоиммуиологический, иммунофлуоресцентный и иммунофермеитный анализы. Одним из чувствительных, быстрых и удобных методов анализа токсинов является твердофазный иммуноанализ. При разработке иммуноанализа токсинов используют антитела, специфичные к токсинам, а в качестве антигена, как правило, используют анатоксины, которые являются инактивированными токсинами. К недостаткам традиционных иммунологических методов относится невозможность одновременно тестировать образец на наличие нескольких биологически активных соединений. Эта проблема решается в случае проведения анализа на белковых гидрогелевых микрочипах, разработанных в данной диссертации, которые позволяют обнаружить присутствие нескольких анатоксинов в анализируемом образце. Для создания белковых микрочипов и оптимизации методов иммуноанализа биотоксииов были использованы антитела и анатоксины, любезно предоставленные коллегами из Института Биоорганической Химии им. Ю. А. Овчинникова и М. М. Шемякина В. А. Несмеянов. Технология гидрогелевых олигонуклсотидных микрочипов была разработана в ИМБ РАН под руководством академика А. Д. Мирзабскова и совершенствуется по настоящее время. Микрочип для одновременного определения нескольких анатоксинов позволит значительно увеличить эффективность анализа, ускорить и миниатюризировать проведение исследований и может найти применение в клинической и лабораторной практике. ГЛАВА 1. В настоящее время известны многие бактериальные, растительные и животные токсины, обладающие сильным токсическим действием на человеческий организм. К наиболее сильным токсинам, продуцируемым микроорганизмами, относятся ботулинический, столбнячный и холерный токсины из токсинов растительного происхождения наиболее сильными являются рицин и абрин. Существует также множество токсинов, секретируемых ядовитыми животными змеями, пауками, скорпионами и т. Большинство биотоксинов имеют полипептидную природу, однако известны и низкомолекулярные соединения, имеющие высокую токсичность, например, тетродотоксин иглобрюхие рыбы, Т2 токсин грибы, токсины синезеленых водорослей. Одной из задач данной диссертационной работы являлось создание модельной системы для одновременного обнаружения нескольких анатоксинов бактериального и растительного происхождения стафилококковый энтеротоксин В, дифтерийный анатоксин, рицин, вискумин, столбнячный анатоксин, летальный фактор сибиреязвенного токсина на основе белковых гидрогслевых микрочипов. Препараты анатоксинов инактивированных токсинов и антител к ним были предоставлены коллегами из ИБХ РАН В. А. Несмеянов. Бактериальные токсины, продуцируются микроорганизмами, подразделяются на два больших класса эндотоксины и экзотоксины. Действие экзотоксинов всегда направлено на какой либо отдел или функцию клетки. Эндотоксин вызывает множество функциональных нарушений вследствие продукции большого количества медиаторов. Основные характеристики эндо и экзотоксинов приведены в таблице 1. Экзотоксины, попадая в клетку путем эндоцитоза, далее действуют в клетке как фермент или ингибитор нейротрансмиттсров.