Исследование круга хозяев, полиморфизма и клонирование генома Х вируса шалота

• Автор: Калошин, Алексей Алексеевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 77 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
Список сокращений
ВВЕДЕНИЕ
I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Общая характеристика вирусов, поражающих культурные виды рода Allium
1.1. Потивирусы
1.1.1. Вирус желтой карликовости лука
1.1.2. Вирус желтой штриховатости лука-порея
1.1.3. Предполагаемые члены группы потивирусов
1.1.4. Нуклеотидные последовательности РНК потивирусов, выделенных из растений рода Allium
1.2. Карлавирусы
1.2.1. Латентный вирус шалота
1.2.2. Латентный вирус чеснока
1.3. Вирусы других групп, обнаруженные в растениях рода Allium.Л
2. X вирус шалота и ХВШ-подобные вирусы
2.1. Морфология и физико-химические свойства вирусных частиц
2.2. Симптоматика и круг хозяев
2.3. Серологические свойства
2.4. Цитопатология
2.5. Характеристика геномной РНК
3. Организация генома и сравнительная характеристика генов карла-, потеке- и ХВШ-подобных вирусов
4. Инфекционные кДНК копии геномных РНК фитовирусов
4.1.Конструкция и экспрессия инфекционных вирусных кДНК
4.2. Определение инфекционности кДНК копий
4.3. Исследование полноразмерных кДНК копий геномных РНК вирусов
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
I. Выделение ХВШ и вирусной РНК

2. Синтез и клонирование кДНК
3. Получение однонаправленных делеций
4. Определение нуклеотидной последовательности
5. Отбор полноразмерных кДНК копий геномной РНК ХВШ
6. Получение протопластов
7. In vitro транскрипция
8. In vitro трансфекция протопластов
9. Электрофорез в сочетании с ИФА (Western blot)
10. Электронная микроскопия
11. Иммуносорбентная электронная микроскопия
12. Компьютерный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей и вторичной структуры РНК
III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.
1. Род Allexviruses: поиск новых видов и предложения по классификации и номенклатуре
2. Моновирусная инфекция растений X вируса шалота: герерогенность нуклеотидной последовательности геномной РНК и морфологическая гетерогенность вирионов
2.1. Морфологическая гетерогенность вирионов
2.2. Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей
2.2.1. 42К белок
2.2.2. 28К белок
2.2.3. 15К белок
3. Полноразмерная кДНК-копия геномной РНК X вируса шалота: получение, клонирование, структура, in vitro транскрипция и тестирование инфекционности
3.1. Клонирование полноразмерной кДНК-копии ХВШ
3.2. Определение инфекционности кДНК-копий ХВШ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
Ас антисыворотка
А-, В-, С-, Б- ВЧ А-, В-, С-, О-вирусы чеснока
БВК Б - вирус картофеля
БВХ Б вирус хелениума
ВАТ вирус аспермии томата
ВЖКЛ вирус желтой карликовости лука
ВЖКР вирус желтой крапчатости риса
ВЖМК вирус желтой мозаики клевера
ВЖШЛП вирус желтой штриховатости лука-порея
вкпц вирус кольцевой пятнистости цимбидиума
вмк вирус мозаики костра
вмцк вирус мозаики цветной капусты
вмч вирус мозаики чеснока
вмчпк вирус мозаики чеснока переносимый клещом
внмкк вирус некротической мозаики красного клевера
вот вирус опаленности голубики
впт вирус погремковости томата
ВРПГ вирус раннего побурения гороха
всмя вирус штриховатой мозаики ячменя
втм вирус табачной мозаики
лвг латентный вирус гвоздики
лвч латентный вирус чеснока
лвш латентный вирус шалота
мвк М вирус картофеля
нвпк нитевидный вирус переносимый клещом
онм олигонуклеотид - направленный мутагенез
ОРС открытая рамка считывания
ПЦР полимеразная цепная реакция
ПЭГ полиэтилен гликоль
хвк X вирус картофеля

7. In vitro транскрипция.
Для синтеза РНК in vitro с полноразмерных кДНК клонов использовалась ДНК-зависимая РНК-полимераза фага Т7. Как было сказано выше, перед 5’-концом полноразмерных кДНК копий вирусного генома имелся промотор для РНК-полимеразы Т7. Перед транскрипцией пробы лианери-зовали после З’-конца ферментом рестрикции Bgl I, сайты которого находятся в молекуле вектора. При этом транскрипты на З’-конце содержат 201 не вирусных нуклеотидов.
Кэппированные in vitro транскрипты получали в обьеме 200 мкл, при следующих условиях: 40 mM Tris-HCl (pH 7,9), 10 шМ NaCl, 6 гаМ MgCh, 10 тМ DTT, 2 mM spermidine, 0,05% Tween-20, 0,5 m7G(5’)ppp(5’)G, по 1,25 мМ ATP, СТР и UTP, 0,125 mM GTP, 20 мг ДНК матрицы, по 200 ед. Rnasin и Т7 РНК-полимеразы.
Реакцию проводили 1 час при температуре 37°С. При необходимости транскрипты концентрировали осаждением этанола. Выход транскриптов обычно составлял 2 мкг на 1мкг ДНК матрицы.
8. In vitro трансфекция протопластов.
Протопласты осаждали центрифугированием 5 мин при 100 g и суспендировали в среде содержащей 0.45 М маннит, 15 мМ MgCh, 0,1% MES, pH 5,6 (среда В), разводя протопласты до концентрации 2,5-3,0 х 106 в мл. К 0,25 мл этой суспензии добавляют 10 мкл раствора РНК (вирионной РНК в количестве 10 мкг и транскриптов 150 мкг) и 0,25 мл среды В содержащей 40% ПЭГ 6000 и инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Затем добавляют 15 мл среды W5, содержащей 154 мМ NaCl, 125 mM СаСЬ, 5 тМ КС1, 5 мМ глюкозу, pH 5,6 - 6,0. Инкубируют 48 часов при комнатной температуре и слабом покачивании.
9. Электрофорез в сочетании с ИФА (Western blot).
Образцы для белкового электрофореза готовились следующим образом. Растительный материал гомогенизировали в жидком азоте, экстрагировали тремя объемами 50 мМ калий-фосфатного буфера pH 7.4, содержа-