Антигенная структура гемагглютинина подтипов H5 и H9 вируса гриппа A и фенотипические свойства их антигенных вариантов

• Автор: Ильюшина, Наталия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 171 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений.

Используемые в работе названия вирусов

Таблица аминокислот.

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Общее строение и характеристика вириона вируса гриппа А

1.2. Характеристика генома вируса гриппа. Функции вирусных белков вируса гриппа А

1.2.1. Сегменты РНК 1, 2, 3. Гены, кодирующие Рполипептиды

1.2.2. 5ый сегмент РНК кодирует нуклеокапсидный белок

1.2.3. 4ый и 6ой сегменты РНК кодируют соответственно белки гемагглютинин и нейраминидазу
1.2.4.7ой сегмент РНК кодирует магриксный белок М1 и трансмембранный белок М2.
1.2.5 8й сегмент РНК кодирует неструктурный белок и белок ядерного экспор та ЕР
1.3. Молекулярные основы антигенной изменчивости вируса гриппа А при эпидемическом процессе.
1.4. Картирование антигенных участков сайтов в трехмерной структуре гемагглютинина вируса гриппа А разных подтипов
1.5. Влияние структурных изменений гемагглютинина вируса гриппа
А на его функциональные свойства
1.6. Вирусы гриппа А подтипов Н5 и 9, как возможные агенты будущих пандемий
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Экспериментальные методы.
2.1.1. Использованные в работе вирусы.
2.1.2 Адаптация вируса к репродукции в легких мышей.
2.1.3. Панель моноклональных антител МКАТ
2.1.4. Селекция есаремутантов
2.1.5. Реакция торможения гемагглютинации РТГА.
2.1.6. Концентрация и очистка вируса.
2.1.7. Твердофазный иммуноферментный анализ ТФИФА
2.1.8. Определение сродства гемагглютинина к сиалосодсржащим субстратам
2.1.9. Титрование инфекционности вирусов на куриных эмбрионах.
2.1 Определение летального эффекта вирусов для мышей
2.1 Реакция нейтрализации инфекционности.
2.1 Метка белков Сгидролизатом хлореллы в зараженных клетках.
2.1 Электрофорез белков в полиакриламидном геле ПААГ
2.1 Радиоиммунопреципитациониый анализ.
2.1 Выделение вирусной РНК.
2.1 Получение вирусной кДНК
2.1 Полимеразная цепная реакция
2.1 Электрофорез в агарозном геле
2.1 Автоматическое секвенирование
2.2. Программная обработка результатов. Анализ нуклеотидных последовательностей.
2.3. Статистическая обработка результатов. Вычисление ошибки эксперимента
Глава 3. Результаты.
3.1. Анализ антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н5
3.1.1. Получение одиночных, двойных и тройных еБсаремутаитов подтипа Н5.
3.1.2. Характеристика мутантов подтипа Н5 в перекрестных иммунологических реакциях РТГА и ТФИФЛ с панелыо моноклональных антител
3.1.3. Секвенирование генов гемагглютинина мутантов подтипа Н5
3.1.4. Построение трехмерной структуры гемагглютинина подтипа Н5
3.1.5. Роль дополнительного сайта гликозилирования в блокировании связывания молекулы гемагглютинина с МКАТ .
3.2. Анализ антигенной структуры гемагглютинина подтипа Н9
3.2.1. Адаптация вируса i 9 к
репродукции в легких мышей
3.2.2.Получение одиночных и двойных мутантов подтипа Н9
3.2.3. Характеристика мутантов подтипа Н9 в перекрестных иммунологических реакциях РТГА и ТФИФА с панелью моноклональных антител.
3.2.4. Секвенирование генов гемагглютинина мутантов подтипа Н9.
3.2.5. Построение трехмерной структуры НА подтипа Н9 Ю
3.3. Фенотипическая характеристика мутантов подтипов
3.3.1. Вирулентность муташов подтипов Н5 и Н9.
3.3.2. Аффинность гемагглютинина мутантов подтипов Н
и Н9 к сиалосодержащим субстратам.
Глава 4. Обсуждение
Выводы.
Список литературы


При этом различия сиаловых субстратов, распознаваемые гемагглютинином еьсарсмутантов, соответствуют различиям в составе рецепторов на хозяйских клетках. Представленные результаты указывают на корреляцию между сниженной вирулентностью и низким сродством к сиалосодержащим субстратам у ейсаремутантов подтипа Н9. Данные по аффинности НА Н9 к сиаловым субстратам демонстрируют сдвиг в рецепторной специфичности еБсаремутантов с заменой Ь к рецепторам птичьего типа. Изучение антигенной структуры НА Н5 и Н9, проведенное в настоящей работе, вносит существенный вклад в развитие представлений об соотношении антигенной специфичности и структурной вариабельности данных вирусов. Поскольку вирусы гриппа А подтипов Н5 и Н9 могут рассматриваться в качестве вероятного источника гена гемагглютинина для возможною высоковирулентного пандемического штамма, исследования вирусов этих подтипов актуальны в медицинском аспекте. Ценность полученных данных обусловлена тем вкладом, который она вносит в понимание молекулярных основ патогенного и эпидемического потенциала вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н9, как вероятных агентов будущей пандемии. Существуют особенности в расположении антигенных сайтов гемагглютинина у вирусов разных подтипов, выявляемые при антигенном картировании с использованием соответствующих трехмерных структур молекул гемагглютинина. Аминокислотные позиции, принадлежащие к одному и тому же сайту в гемагглютининах одних подтипов, могут соответствовать разным антигенным сайтам у других подтипов НА. Совпадение позиций аминокислотных замен у ряда сясаремутантов подтипа Н5 с заменами дрейфовых вариантов подтипа Н2 указывает на вероятную роль антигенных сайтов, выявленных в диссертационной работе, при дрейфе в случае заноса вирусов подтипов Н5 или Н9 в человеческую популяцию. Аминокислотные замены у ряда еБсаремутантов подтипов Н5 и 9 способны оказывать плейотропный эффект на их фенотипические свойства, такие как аффинность гемагглютинина к сиалосодержащим аналогам рецепторов хозяйских клеток иили вирулентность. При этом у одних и тех же евсаремутантов может наблюдаться четкая корреляция между изменениями разных фенотипических свойств. С помощью детального картирования антигенных сайтов гемагглютинина подтипов Н5 и Н9, впервые проведенного в диссертационной работе с использованием трехмерной структуры гемагглютининов соответствующих подтипов, создана основа для структурного анализа эволюционных изменений вирусов этих подтипов, являющихся вероятными агентами будущих пандемий. Считаю своим приятным долгом выразить глубокую и искреннюю благодарность моему научному руководителю, заведующему лабораторией физиологии вирусов ГУ ПИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, членкорреспонденту РАМН, профессору Каверину Н. В. за предоставленную тему диссертационной работы и за постоянную и всестороннюю помощь, оказанную в процессе моих исследований. Сердечно благодарю кандидата биологических наук Рудневу И. А. за ценные обсуждения, сотрудничество и неоценимую помощь в работе. Искренне благодарю кандидата биологических наук Гамбарян за помощь и ценные замечания при проведении экспериментов, связанных с определением сродства гемагглютинина к сиалосодержащим субстратам. Выражаю признательность доктору биологических наук Варич Н. Л., а также остальным сотрудникам лаборатории физиологии вирусов за дружеское отношение и поддержку в ходе научной работы. Глава 1. Исследуемая в работе проблематика лежит в областях молекулярной биологии и физиологии вирусов гриппа. Данные, приводящиеся в обзоре литературы, не претендуют на полное освещение этих областей, но отражают их в той мере, в какой это необходимо для адекватной оценки полученных экспериментальных результатов работы. Вирусы гриппа являются оболочечными вирусами и принадлежат к семейству xvii . Они разделяются на типы А, В и С па основании антигенных свойств главных внутренних белков. В современной классификации вирусов каждый из типов рассматривается как отдельный род I vi , I vi В, I vi С. Кроме человека вирусы гриппа способны поражать также и животных прежде всего, лошадей, свиней и птиц x. Существенные различия касаются течения заболевания.