Экспрессия цитохромов Р45011А1 и 2В4 в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

• Автор: Сидорович, Вадим Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

1.1. Структура митохондриальных цитохром Р0зависимых ферментных систем

1.2. Экспрессия цитохромов Р0 в дрожжах . vii

1.3. Экспрессия митохондриальных цитохромов Р0 в дрожжах

. vii

1.4. Экспрессия митохондриальных цитохромов Р0 в культуре клеток млекопитающих

1.5. Экспрессия митохондриальных цитохромов Р0 в ii i

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Конструирование векторов для экспрессии цитохрома Р0 II1, НАДФН адренодоксинредуктазы и адренодоксина

3.2. Анализ субклеточной локализации белковкомпонентов цитохром

Р0 А1зависимой ферментной системы в дрожжах .vii

3.3. Анализ взаимодействия рекомбинантных Р0 А1 и АР с микросомальной мембраной
3.4. Определение содержания холофермеитов 0 А1 и стР0 А1 в микросомах дрожжей .vii
3.5. Определение НАДФНзависимой цитохром средуктазной активности
3.6. Определение активности рекомбинантных цитохромов Р0 А1 i vi
3.7. Конструирование векторов для экспрессии цитохрома Р0 2В4
3.8. Анализ субклеточной локализации рекомбинантных цитохромов Р0 2В4 в
дрожжах .vii
3.9. Анализ взаимодействия рекомбинантных цитохромов Р0 2В4 с микросомальной мембраной
3 Определение содержания холо и апоферментов рекомбинантных цитохромов Р0 2В4 в микросомах дрожжей .vii
3 Определение каталитической активности рекомбинантных цитохромов
Р0 2В4 в реакции Одеалкилирования 7пентоксирезоруфина
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
I1ИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1 , 9,секохолестатриен5,7, триол1 а,ЗР,
1 а,дигидроксивитамин 3 а,,ОНЬОз 9,секохолестатриен5,7, тетрол1 а.Зр,,
1 а,,тригидроксивитамин 3 ЗНТП Знетранслируемая последовательность
3 9,секохолестатриен5,7,диол3р, гидроксивитамин
3 9,сскохолестатриен5,7,диол3р, гидроксивитамин П3 а.о. аминокислотный остаток
АД адрснодоксии феррсдоксин, экспрессирующийся в митохондриях коры надпочечников
АР адренодоксинредуктаза НАДФНферредоксиноксидоредуктаза КФ .2, экспрессирующаяся в митохондриях коры надпочечников Д ГГ литиотреитол
МОТМС метокситриметилсилильные производные
ИАДН восстановленный никотинамиддинуклеотид
НАДФН восстановленный никотинамиддинуклеотидфосфат
ОР оксидоредуктаза, НАДФцитохром Р0оксидоредуктаза КФ 1.6.2.
ОРС открытая рамка считывания
РД рснодоксин феррсдоксин, экспрессирующийся в митохондриях почек РР рснодоксинредуктаза НАДФНферредоксиноксидоредуктаза КФ .2, экспрессирующаяся в митохондриях почек
Р0 2В4 цитохром Р0 2В4 КФ 1.1, продукт гена
Р0 А1 цитохром Р0 А1 Р0 КФ 1.6, продукт гена II
Р0 А1 цитохром Р0 А1 агидроксилаза КФ 1.1, продукт гена СУРНА
ПААГДСН полиакриламидный гель с додсцилсульфатом натрия п.н. пар нуклеотидов ФД феррсдоксин
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
ФР НАДФНферредоксиноксидоредукгаза КФ .
холестерин Д5холестснЗрол
ЭДТА этилендиаминтетраацетат
ЭР эндоплазматический рстикулум
НЕРЕ8 К2гидроксиэтилпиперазинЫ2этансульфоновая кислота
Кт константа Михаэлиса
ТНС 5рхолестанЗа, 7а, триол
ТсНС холесганЗа, 7а, , тетрол
гтах максимальная скорость реакции
ВВЕДЕНИЕ


Исследовать возможность экспрессии функционально активного митохондриального цитохрома Р0 А1 млекопитающих вне митохондрий клеток дрожжей. Исследовать влияние концевой адресующей последовательности и Сконцевого гексагистидинового пептида на экспрессию микросомальиого цитохрома Р0 2В4 млекопитающих в дрожжах . Б результате проведенных исследований осуществлено конструирование новых векторных систем, обеспечивающих коэксирессию митохондриальной цитохром Р0 А1зависимой ферментной системы млекопитающих в мембранах эндоплазматического ретикулума и цитозоле клеток дрожжей . Р0 2В4 в клетках . Показано, что для получения функционально активного цитохрома Р0 А1 вис митохондрий дрожжей достаточно экспрессировать кДПК зрелой не содержащей концевого адресующего пептида последовательности цитохрома Р0 А1. Зрелая форма Р0 А1 является мембранным белком эндоплазматического ретикулума дрожжей . Обнаружено, что зрелые последовательности АР и АД экспрессируются в функционально активной форме. Низкий уровень экспрессии адренодоксииа в цитозоле дрожжевых клеток является лимитирующим фактором при реконструкции активности цитохрома Р0 А1 i vi. Обнаружено, что концсвой сигнальный пептид цитохрома Р0 А1 обеспечивает более эффективный биосинтез холоферменга цитохрома Р0 2В4, чем концевой сигнальный пептид цитохрома Р0 2В4. Р0 2В4 и на взаимодействие с НАДФНцитохром Р0оксидоредуктазой дрожжей. ГЛАВА 1. Цитохромы Р0 Р0, надсемейство гемтиолатных белков, образующих в восстановленном состоянии комплекс с СО с максимумом поглощения при 0 нм. Р0 КФ 1. Такие ферменты называются монооксигеназами или оксидазами со смешанной функцией, так как наряду с оксигеназным внедрением одного атома кислорода в субстрат второй атом кислорода по оксидазному механизму восстанавливается до воды АН2Н АОННгО Метелица, . Распространенность Р0 в природе чрезвычайно широка, они обнаружены в клетках эукариот позвоночные, беспозвоночные, грибы и растения и прокариот, отсутствуя только у строю анаэробных бактерий Арчаков, , . Р0 принимают участие в метаболизме широкого спектра соединений экзо и эндогенного происхождения v, . К настоящему времени установлена первичная последовательность более 0 цитохромов Р0 0. Несмотря на более чем тридцатилетнюю историю исследований этого класса ферментов, до последнего времени трехмерная структура была известна лишь для шести водорастворимых Р0 1 , , 2 vi, i, viv, , 8 , , 7I Vi, , 1 , и I3 , . Многолетние усилия по кристаллизации микросомальных цитохромов Р0 млекопитающих привели к успеху лишь недавно
была получена трехмерная структура цитохрома Р0 2С5 СУР2С5 с делецисй Ыконцевой микросомальной адресующей последовательности Vii, . В отличие от бактериальных гемопротеинов, все Р0 эукариот являются мембраносвязанными белками. Р0 млекопитающих локализованы в мембранах эндоплазматического ретикулума микросомальныс Р0 и во внутренней мембране митохондрий митохондриальные Р0. При огромном количестве различных Р0 различают всего три основных типа молекулярной организации Р0зависимых монооксигелазных ферментных систем. Первый, эволюционно наиболее древний, обнаружен у бактерий и состоит из трех водорастворимых ферментов. В случае СУР1 это НАДИспсцифический флавопротеин, негеминовый серусодержащий белок путидаредоксин и, собственно. Р0. Первые два компонента выполняют роль переносчиков электронов. Характерной особенностью этой системы является ее абсолютная специфичность по отношению к субстрату камфоре и высокая степень лабильности СУР 1 в отсутствие субстрата. Подавляющее большинство эукариотических Р0 локализованы в эндоплазматическом ретикулуме. В состав микросомальиых Р0зависимых ферментных систем входит как минимум два белка НАДФНцитохром Р0оксидоредуктаза КФ 1. ОР и Р0. Два других переносчика электронов ПАДНци гохром Ь5 редуктаза КФ 1. Ь5. Митохондриальные Р0зависимые монооксигеназные системы объединяют в своей структуре признаки бактериальной и . НАДФНферредоксиноксидоредуктаза КФ . ФР и ферредоксин ФД водорастворимы и локализованы в матриксе митохондрий, третий Р0, подобно микросомальным Р0, является мембранным белком внутренней мембраны митохондрий.