Новая Н + , К +-АТФаза человека: генно-инженерный и иммунохимический подходы к поиску функционально активного фермента

• Автор: Корнеенко, Татьяна Васильевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Основные структурные черты ХОАТФаз

1.2. Семейство генов ЫаКНКЛТФаз, ткансспецифичность и сплайсинг

1.3.МаКАТФаза

1.4. Н,КАТФаза желудка

1.5. 3Субъединицы Х,КА1 Фаз

1.6. Н ,КАТФаза нежелудочного типа

1.6.1. Идентификация, структура гена и белка

1.6.2. Функциональная экспрессия ЬГДАТФаз

1.6.3. Ингибиторы 1Г,КАТФазы нежелудочного типа
1.6.4. Вопрос о рсубъединице
1.7. Роль 1ГКАТФазы
ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ
2.1. Получение рекомбинантных белков фрагментов АТР1АЛ авд
2.2. Получение специфических моно и поликлональных антител к асубъсдинице Н,КАТФазы человека, кодируемой геном ара. Характеристика антител
2.3. Исследование гканесиецифичности экспрессии гена ара 1
2.4. Определение внутриклеточной локализации НК и Па,КАТФазы
2.5. Поиск и характеризация новых рсубъединиц Х,КАТФаз
2.6. Идентификация истинной рсубъединицы партнера ст
ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Четвертичная структура НКАТФазы нежелудочного типа
3.2. Поляризация и соргинг Х,КАТФаз
3.3. Систематика ХКАТФаз
3.4. Проблема выделения Н,КАТФазы нежслудочного типа
3.5. Физиологическая роль Н,КАТФазы нежелудочного типа
ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
4.1. Материалы
4.2. Методы исследования
Выводы
Благодарности
Список сокращений
Список литературы


Многообразие сгруктур белков зачастую увеличивается при помощи альтернативного сплайсинга гранскриптов а также других механизмов, например, использования альтернативной инициации транскрипции. Для некоторых ионтранспортирующих систем его использование хорошо установленный факт, как например в случае Са2АТФазы плазматических мембран 4. При этом происходит удержание интрона, что должно приводить к сдвигу рамки считывания и продукции белка, в котором делегированы функционально важные участки. В случае Н,КАТФазы нежелудочного типа известно существование альтернативного транскрипта, повидимому, возникающего благодаря использованию инициации транскрипции из интрона 1, что должно приводить к делеции Ыконцевого домена у крысы , или, наоборот, вставке дополнительного 1Чконцсвого фрагмента у кролика рис. Существует точка зрения, что описанные транскрипты являются продуктами так называемого аберрантного сплайсинга и не имеют какойлибо важной функциональной роли. В случае Рсубъедиииц известно наличие альтернативной инициации для гена р1, но это ведет только к изменению длины 5ЦТК. Возможно, что единственным примером истинного альтернативного сплайсинга в семействе Х,КАТФаз, который бы затрагивал кодирующую часть, является альтернативная селекция донорного сайта в нитроне 2 Рш . При этом образуется два варианта белка ргп, один из которых имеет четыре дополнительных аминокислотных остатка в примембранной области . Интересно, что для Рт описано также существование мипорного аберрантного транскрипта с делецией экзона 3, кодирующего трансмембранный участок . У р2 дрозофилы также известно два альтернативных транскрипта . Рис 2. Продукты альтернативных транскриптов аф1а Показано выравнивание Мконцевых аминокислотных последовательностей асубъединиц Н,КАТФаз нежелудочного типа. Выделены остатки, идентичные во всех последовательностях. МИОКТР СТКЖЧКРАПОВЭ ТКЙТКОЬССЕЕ Этот фермент был открыт в х годах XX века, когда Дженс Скоу, изучая действие анестетиков на нервные волокна краба, зарегистрироват АТФгидролазную активность в мембранах седалищного нерва краба, которая увеличивалась при добавлении ионов натрия, и калия . Ка,ЮАТФаза является наиболее изученным представителем семейства Кзависимых АТФаз. Это интегральный мембранный белок, участвующий в транспорте ионов в межклеточное пространство и ионов К в цитозоль, в стехиометрии 32 5. Этот транспорт создает как химический так и электрический трансмембранный градиент. Электрический градиент важен для образования потенциала покоя клетки и энергии возбуждения мышечной и нервной ткани. Градиент Ыат используется для многочисленных транспортных процессов, включая транспорт глюкозы, аминокислот внутрь клетки. Физиологическое значение КаКАТФазы велико, например, присутствуя в мембране эпителия почечных канальцев и ворсинок кишечника, фермент создает ионный градиент, который используется для реабсорбции жидкости и электролитов. ШКАТФаза имеет а субъединицу с М 03 кОа и гликозилированную рсубъединицу с М кБа с ес белковой составляющей около кБа 5. КьАТФаза функционирует как димер агрг 5,. На сегодняшний день существует около десяти моделей мембранной топологии КаКАГФазы, но наиболее признана модель, предложенная Лингрелом с соавт. М1М рис. Ыа,КАТФазы ответственна за ферментативную активность и содержит сайт связывания субстрата. Фосфорилирование асубъединицы в процессе транспорта Ыа и К сопряжено с конформационными изменениями фермента. Известно, что аминокислотные остатки, находящиеся на цитоплазматической стороне между М4М5 вовлечены в каталитический гидролиз АГФ 35. Рецептором фосфатных групп АТФ считают Аэр9, который находится в большом цитоплазматическом домене между М4М5 5. МаКАТФаза может иметь дополнительный гидрофобный полипептидный компонент, так называемую усубъединицу ,, которая, однако, не требуется для образования каталитически активного фермента . Обычно КаЮАТФаза экспрессируется на базолатеральной поверхности клетки, где, например в почках, она вовлечена в рсабсорбцию .