Регуляторное действие 17 β-эстрадиола и 1,25-дигидроксивитамина D3 в клетках некоторых раковых линий

• Автор: Аксенов, Николай Леонидович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 121 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эстрогеновый рецептор и действие Кэстрадиола

1.2. Витамин И3 и его рецептор

1.3. Ген фактора роста кератиноцитов представитель семейства генов факторов роста фибробластов

1.4. Семейство протеинкиназ и МАРкиназ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды

2.2. Клеточные культуры и выделение РНК

2.3. Оценка пролиферативной способности клеток

2.4. Приготовление клеточного лизата
2.5. Выделение белка и иммунопреципитация
2.6. Микрочиповый анализ
2.7. Вестернблотанализ
2.8. Ревертазнотранскрипционная реакция
2.9. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени
2 Клонирование фрагмента в плазмидный вектор РвЕМТ Еаэу
2 Выделение плазмиды
2 Сиквенс
2 Измерение МАРкиназной активности
2 Метод анализа РНК при помощи защиты от расщепления РНКазами
2 Программное обеспечение и базы данных
2 Реактивы и материалы
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Исследование регуляции гена к Рэстрадиолом
и 1,дигидроксивитамином Оз
3.1.1. Исследование экспрессии рецептора витамина Из в клетках линии МСР7
3.1.2. Компьютерный анализ последовательностей в 5фланкирующей области гена
3.1.3. Исследование действия 1,дигидроксивитамина Эз при помощи метода микрочипового анализа
3.1.4. Оценка методом количественной ПЦР продукции РНК геном кпод воздействием 1,дигидроксивитамина Оз и Рэстрадиола
3.1.5. Вестернблотанализ уровней экспрессии гена кв клетках линий МСР7 и КМСаР
3.2. Влияние 1,дигидроксивитамина и Рэстрадиола на
пролиферацию исследуемых раковых клеточных линий и элементы МАРкиназного каскада
3.2.1. Пролиферация клеток линий МСР7 и ЬИСаР возрастает под воздействием рэстрадиола и тормозится под воздействием
1,дигидроксивитамина Из
3.2.2. Кратковременные воздействия Рэстрадиола и 1,дигидроксивитамина Из активируют МАРкиназы в клетках
МСР7 и ЬИСаР
3.2.3. Длительное воздействие 1,дигидроксивитамина И3 подавляет Рэстрадиолзависимую активацию МАРкиназ в клетках
линиии ЬЫСаР
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Такого рода элементы локализованы в интронах и 5 фланкирующих областях генов , , . После связывания ядерных рецепторов с ДК, изменение уровней транскрипции мРНК происходит за счет прямого или опосредованного белокбелкового взаимодействия с транскрипционным комплексом, в результате чего происходит увеличение или уменьшение уровней транскрипции мРНК и, соответственно, продукции белка, кодируемого тем или иным геном в клетке , , . Все ядерные рецепторы имеют схожую доменную структуру белковой молекулы и по этому признаку объединены в одно семейство , . Изучение процессов и механизмов влияния лигандов ядерных рецепторов и самих белков этих рецепторов на регуляторные каскады и транскрипцию генов является важным направлением в исследованиях канцерогенеза. Одним из ключевых элементов в регуляции этих процессов является взаимодействие ядерных рецепторов с определенными последовательностями ДНК, называемыми гормонвзаимодействующими элементами , , . Одним из подходов к комплексной терапии онкологических заболеваний является использование гормонов и гормоноподобных соединений, а также соединений, их ингибирующих, для подавления пролиферации раковых клеток посредством изменений в регуляторных путях и уровнях транскрипции генов с помощью лигандов белков ядерных рецепторов i, , . В данной работе исследуются некоторые аспекты геномного и не геномного действия лигандов ядерных рецепторов РЭСтрадиола и 1,дигидроксивитамина 3 ,23 в клетках линий и 7 соответственно, рака простаты и рака молочной железы. Рак простаты является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований у мужчин и стоит на втором месте после рака легких в ряду причин смертности в результате онкологических заболеваний i, , . 3 ниже нмл имеют в 1. 3 выше среднего i . i . Раки молочной железы также являются весьма частым онкологическим заболеванием. В развитых странах рак молочной железы занимает первое или второе место по частоте онкологических заболеваний у женщин всех случаев Трапезников, Экхардт, . В противоположность ,23, рэстрадиол стимулирует процессы во многих раковых клеточных линиях, в особенности при раке молочной железы, и подавление его активности с помощью различных методов, среди которых существенное место занимает применение антиэстрогенов, способствует замедлению роста гормонзависимых опухолей . Впервые эффект рэстрадиола был описан в работе Липпмана и Волана i, , . Эти авторы показали, что подавленный антиэстрогеном тамоксифеном рост клеток линии 7 рака молочной железы эстрогенрецептор позитивной возобновлялся при добавлении С тех пор было проведено множество исследований в этом направлении. Описываются также фактор роста кератиноцитов и митогенактивируемые протеинкиназы, поскольку они являются основными мишенями действия 1,0Н3и рэстрадиола, исследуемого в данной работе. Цель данной работы заключалась в том, чтобы исследовать действие 1,ОН2Оз и рэстрадиола на клетки линии рака груди и рака простаты, и выявить их участие в регуляции гена фактора роста кератиноцитов а также их влияние на некоторые компоненты МАРкиназного пути. Выявить при помощи различных молекулярнобиологических методик влияние 1,дигидроксивитамина и3эстрадиола на регуляцию гена фактора роста кератиноцитов к, а также определить экспрессию рецептора витамина Ц в клетках рака молочной железы линии МСР7. Найти потенциальные регуляторные элементы НЯЕ в 5фланкирующей области гена с помощью компьютерных программ и баз данных. Изучить влияние 1,0Н3 и рэстрадиола на уровни пролиферации в клетках линий рака груди линия МСР7 и рака простаты линия ЫСаР. Определить влияние 1,ОН2Ц3 и 3эстрадиола на активацию и ингибирование некоторых компонентов МАРкиназного каскада, передающего сигнал от поверхности клетки внутриклеточным структурам.