Физико-химическая характеристика гамма-цистатионазы печени крыс

• Автор: Лупу, Емилия Ивановна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 118 c. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава I. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ЦИСТАТИОНА

1. Пересульфирование основа метаболизма серу

содержаних аминокислот

2. Цистатионаза из различных источников

3. Метода выделения и очистки цистатионазы

из печени крыс .

4. Спектральные свойства препаратов, их молекулярная масса и содержание пиридоксальфосфата

5. Макромолекулярная структура

6. Ферментативные реакции, катализируемые циста тионазой.
Механизм десульфирования ьцястеина и расщепления замещенных ьаминокислот .
7. Строение активного центра цистатионазы
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава П. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛЫ.
Глава Ш. ПОЛУЧЕНИЕ ВЫС0КЧИЩЕНН0Г0 ПРЕПАРАТА ЦИС
ТАТИОНАЗЫ ПЕЧЕНИ КШС И НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА .
1. Выделение и очистка цистатиона зы
2. Кристаллизация фермента
3. Характеристика препаратов фермента .
Глава 1У. ИССЛЕДОВАНИЕ ВТОРИЧНОЙ И ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
ЦИСТАТИОНАЗЫ.
1. Вторичная структура фермента
2. Влияние додецилсульфата натрия на конформационные изменения молекулы фермента
Глава У. ИССЛЕДОВАНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ЦИСТАТИОНАЗЫ .
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ЛИТЕРАТУРА


В ходе проведения этих исследований стала очевидной необходимость получения высокоочищенных препаратов изучаемых ферментов. Эта задача была решена для большого количества лиаз, что позволило более детально исследовать каталитические свойства пиридоксальфосфатсодержащих ферментов, осуществляющих реакции замещения аминокислот при углеродном атоме. По мере исследования деталей механизма пиридоксалевого катализа выяснилось, что большую роль в проявлении биологической активности ферментов играет структурная организация молекулы и динамика ее изменения в процессе катализа. Следует отметить, что до последнего времени остаются недостаточно изученными лиазы, катализирующие реакции по типу с ,р и р , элиминирования аллииназа, цистатионаза и др. Полифункциональность этого фермента и небольшое число субъединиц, составляющих его молекулу, делает исследование свойств и структурных особенностей уцистатионазы, взаимосвязи между ними особенно актуальным, т. Исследование у цистатионазы представляет также специальный интерес, поскольку этот фермент обеспечивает в метаболизме серусодеряащих аминокислот у человека и животных заменимость ь цистеина в результате его образования из ь метионина. Цель работы. ПЛФ в стабилизации структуры фермента и создании его биологически активной конформации. Научная новизна работы. Разработан метод очистки уцистатионазы печени крыс, отличительной особенностью которого является совмещение на одном из этапов очистки процесса высаливания белка сульфатом аммония с фракционированным осаждением этанолом. На гомогенном препарате фермента были исследованы основные свойства белка, такие как его молекулярная масса и изоэлектрическая точка, условия его хранения, стабильность фермента по отношению к изменениям , нагреванию и охлаждению, константа седиментации, определен аминокислотный состав. Разработаны условия кристаллизации и впервые получены кристаллы фермента из растворов полиэтиленгликоля ПЭГ. С использованием метода кругового дихроизма 1Щ получены приоритетные данные о вторичной и третичной структурах цистатионазы из печени крыс. Методом электронной микроскопии с одновременной гельфильтрацией изучена четвертичная структура фермента, влияние на нее различных реагентов. Установлено, что цистатионаза печени крыс является олигомерным ферментом, состоит из 4 идентичных субъединиц с молекулярной массой кД. А упакованы в структуру типа изологического квадрата со стороной А. Практическая ценность работы. Разработанный метод очистки К цистатионазы характеризуется простотой, доступностью, относительно малой трудоемкостью и хорошей воспроизводимостью поэтому он может быть рекомендован для использования в лабораториях научноисследовательских институтов и кафедр, занимающихся изучением данного фермента. Разработка условий кристаллизации позволила наметить пути к получению крупных кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа фермента. Исследование роли кофактора, его спектроскопических характеристик открывает путь к созданию детальной молекулярнокинетической модели действия цистатионазы и объяснению механизма олигомеризации фермента. Цистатионазапиридоксальфосфатзависимая лиаза один из основных ферментов, катализирующих взаимопревращения серусодержащих аминокислот, впервые была идентифицирована в препаратах из печени крыс Е. В. Горяченковой и др. Выделение и исследование фермента связаны с многолетними работами по изучению процессов пересульфирования, интерес к ним велик и ныне. Пересульфирование процесс переноса серы между гомоцистеином и цистеином играет большую роль в метаболизме живых организмов. Оба направления переноса серы и ферментативные механизмы их осуществления различны в различных таксономических группах организмов. У животных рис. В этом процессе принимают участие два различных пиридоксальфосфатзависимых фермента. Один из них цистатионинсинтаза К. Ф. А. К.Ф. Рассматриваемая ферментативная система многие годы привлекает внимание исследователей. СЕ Рис. I Пути пересульфирования в различных таксономических группах.