Создание рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены факторов роста кровеносных сосудов и изучение влияния этих вирусов на ангиогенез in vivo

• Автор: Авдеева, Светлана Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 141 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

Глаза 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аденовирусы как векторы для переноса генетической информации.

1.1.1. Общая характеристика аденовирусов человека.

1.1.2. Векторы на основе аденовирусов человека.

1.1.3. Особенности структурнофункциональной

организации аденовируса птиц СЕЬО.

1.1.4. Векторы на основе аденовируса птиц СЕЬО.

1.2. Факторы роста кровеносных сосудов.

1.2.1. Ангиогенин.

1.2.1.1. История открытия и свойства белка ангиогенина.

1.2.1.2. Роль ангиогенина в неоваскуляризации.
1.2.1.3. Внутриклеточные функции ангиогенина.
1.2.1.4. Другие функции белка.
1.2.2. УЕСБ фактор роста эндотелия сосудов.
1.2.2.1. Свойства и функции белка.
1.2.2.2. УЕСБ А.
1.2.2.3. Другие члены семейства 7. 4
1.2.2.4. Исследование способности УЕСЕ
индуцировать ангиогенез в организме животных и человека.
1.2.3. Другие факторы роста кровеносных сосудов.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы.
2.1.1. Вирусы и бактериальные штаммы.
2.1.2. Клеточные линии.
2.1.3. Плазмидные векторы.
2.1.4. Ферменты и другие реактивы.
2.1.5. Животные.
2.2. Методы.
2.2.1. Выделение и очистка плазмидной ДНК.
2.2.2. Выделение аналитических количеств
плазмидной ДНК.
2.2.3. Гидролиз ДНК специфическими
эндодезоксирибонуклеазами.
2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.
2.2.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля.
2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК.
2.2.7. Трансформация клеток .i.
2.2.8. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2.2.9. Полимеразная цепная реакция.
2.2 Синтез дезоксиолигонуклеотидов.
2.2 Трансфекция клеток линии 3 или для получения рекомбинантных аденовирусов.
2.2 Накопление вирусов.
2.2 Очистка и концентрирование аденовирусов.
2.2 Титрование вирусов.
2.2 Выделение вирионной ДНК.
2.2 Выделение ДНК из клеток, зараженных аденовирусом.
2.2 Трансфекция хориоаллантоисной мембраны.
2.2 Определение активности секретируемой щелочной фосфатазы.
2.2 Электрофорез белков в ПААГДСН .
2.2 Иммуноблоттинг i.
2.2 Хирургические манипуляции с лабораторными животными.
2.2 Введение рекомбинантных вирусов в мышечные клетки.
2.2 Гистологический анализ.
2.2 Определение логфазы для микроорганизмов.
2.2 Определение влияния ангиогенина на рост микроорганизмов.
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Конструирование рекомбинантных аденовирусов на
основе генома аденовируса птиц и генома
аденовируса человека 5 серотипа.
3.1.1. Создание плазмидных конструкций, несущих гены и V.
3.1.2. Анализ экспрессии генов и V, содержащихся в плазмидных векторах.
3.1.3. Получение аденовирусов , V и методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток.
3.1.4. Детекция экспрессии генов и V в культуре клеток, зараженных рекомбинантными аденовирусами и V.
3.2. Индукция неоваскуляризации в конечностях лабораторных животных после введения
рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.
3.2.1. Введение репортерных генов и в клетки мышцы крысы при помощи рекомбинантных аденовирусов.
3.2.2. Индукция неоваскуляризации в мышцах крыс после введения рекомбинантных аденовирусов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов.
3.3. Исследование антимикробной активности
ангиогенина.
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Наше исследование направлено на создание генноинженерных конструкций, индуцирующих рост кровеносных сосудов в конечностях млекопитающих в результате доставки в ткани конечностей аденовирусных векторов, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов. Аденовирусные векторы широко применяются для транзиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих i viv и i vi. Исследуется применение векторов на основе аденовирусов человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины, а также для генной терапии. Атеросклероз с постепенным сужением полости артерий и последующем уменьшением кровяного тока до сих пор остается одной из самых серьезных проблем в мире. Известно, что в организме человека имеются естественные регуляторы роста кровеносных сосудов, способствующие образованию коллатералей, обходящих места закупорки артерий. Однако белки факторов роста кровеносных сосудов, при введении в организм, имеют короткий период полураспада i . Поэтому, для лечения ишемических заболеваний перспективными являются геннотерапевтические методы. Генная терапия предоставляет возможность для повышения в организме уровня белков факторов роста кровеносных сосудов и поддержания его длительный период времени. Существует множество факторов роста кровеносных сосудов, доставка которых в организм при помощи методов генной терапии, могла бы привести к лечебной неоваскуляризации. У большинства ангиогенных факторов уже исследуется механизм действия и эффективность индукции роста новых кровеносных сосудов. А . ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы являлось получение рекомбинантных аденовирусов СЕЬОАЫС, СЕЬО 7 и АбАЫС, несущих гены факторов роста кровеносных сосудов, и исследование возможности индукции неоваскуляризации в результате внутримышечного введения вирусов СЕЬОАЫС, СЕЪО УЕСЕ и АбАТО лабораторным животным. Создание векторов на основе аденовируса птиц СЕЬО, несущих гены АЫС и , методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток ЬМН. Создание вектора на основе аденовируса человека 5, несущего ген АШ, методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток 3. Изучение действия 7 и АИв, экспрессируемых с генов в составе рекомбинантных аденовирусов, на ангиогенез в мышечной ткани конечностей лабораторных животных. Разработка системы проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хориоаллантоисной мембраны куриных эмбрионов. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. Созданы рекомбинантные вирусы на основе аденовируса человека типа 5 и на основе аденовируса птиц , несущие гены факторов роста кровеносных сосудов V1 и . Показано, что созданные нами рекомбинантные аденовирусы индуцируют прирост кровеносных сосудов в мышечной ткани конечностей лабораторных животных. Отработана система проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, при помощи трансфекции хориоаллантоисной мембраны куриных эмбрионов. Показано, что не проявляет специфической антимикробной активности. НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Нами впервые были получены рекомбинантные аденовирусы , V и , несущие гены факторов роста кровеносных сосудов. Была продемонстрирована экспрессия генов и V в составе рекомбинантных аденовирусов. Для проверки биологической активности генов факторов роста кровеносных сосудов, находящихся в плазмидных векторах, нами была разработана тестсистема на основе трансфекции хориоаллантоисной мембраны куриных эмбрионов рекомбинантными плазмидами. Нами проведено исследование антимикробной активности ангиогенина, в ходе которого показано, что АС не обладает антимикробной активностью. Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Нами показано, что аденовирусные векторы, в том числе и векторы на основе Ас птиц СЕЬО, осуществляют эффективный перенос терапевтических генов в мышечные клетки и могут быть использованы в генной терапии ишемических заболеваний. Можно ожидать, что векторная конструкция на основе ДНК аденовируса птиц СЕЬО после соответствующей модификации инактивирования области САМ1 окажется эффективной для использования в медицине, в частности в терапии ишимизированных конечностей у человека.