Исследование ненативных форм глобулярных белков методом ЯМР

• Автор: Прохоров, Дмитрий Анатольевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 116 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Тепловое равновесие в системе спинов

1.2. Спиновая диффузия в диамагнитных ионных кристаллах.

1.3. 1НЯМР спектры нативных белков

1.4. Условия возникновение и распространения спиновой диффузии

в белках.

1.5. Динамические характеристики нативных белков

1.6. Равновесные промежуточные состояния белков.

1.7. Связь плотности упаковки белков с экспериментальными параметрами.

1.8. Спиновая диффузия и интегральные структурнодинамические характеристики глобулярных белков. Спектр спиновой диффузии
1.9. Парамегр жесткости и компактность глобулярных белков.
1 Применение метода спиновой диффузии к исследованию ненативных состояний белков.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Список используемых сокращений и обозначений.
2.2. Объекты исследования и материалы.
2.3. НЯМР спектроскопия.
2.3.1. Спектры спиновой диффузии
2.3.2. Метод внерезоиансного возбуждения спиновой
диффузии
2.3. Малоугловое диффузное рассеяние рентгеновских лучей в растворе.
2.4. Спектроскопия кругового дихроизма
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Исследование алактальбумина человека методом спиновой диффузии
3.2. Разворачивание расплавленной глобулы карбоангидразы В гуанидингидрохлоридом.
3.3. Параметры спиновой диффузии, определяющие индивидуальные и коллективные свойства молекул.
3.4. Разворачивание нативной карбоангидразы В растворами мочевины. Самоассоциация компактного ненативного состояния
3.5. Исследование ассоциатов промежуточного состояния карбоангидразы В при концентрации мочевины 4.2М.
3.6. Заключение.
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


НЯМР, круговой дихроизм, синхротронное малоугловое рентгеновское рассеяние провести изучение динамики формирования ассоциатов ненативных форм белков, условий, приводящих к самоассоциации, роли растворителя в этом процессе. Научная новизна и практическая значимость. ЯМР высокого разрешения предложен новый методический подход внерезонансное возбуждение спиновой диффузии, позволяющий исследовать молекулярную ассоциацию и дающий возможность получить информацию, как о коллективных, так и индивидульных свойствах ассоциатов и входящих в их состав белковых молекул и растворителя. Рассмотренная в работе система карбоангидраза В коровырастворитель может быть использована в качестве удобной модели в дальнейших исследованиях по выяснению молекулярных механизмов образования амилоидов, приводящих к прионным заболеваниям человека и животных, а как следствие, устранению причин их вызывающих. Таким образом, в перспективе, результаты работы найдут свое применение в биомедицине. Реализованный в работе новый методический подход внерезонансного возбуждения спиновой диффузии будет полезен исследователям, занимающихся изучением межмолекулярных процессов в растворе с использованием ЯМР. Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Ядерный магнитный резонанс, открытый в году оказался настолько успешным методом для исследования разного рода молекул, что за лет своего существования и непрерывного развития, как техники, так и множественности его применений, сейчас уже трудно найти области науки и промышленности, где бы он ни применялся. Краткое описание основных теоретических положений ядерного магнитного резонанса даст возможность ввести понятие спиновой диффузии, а также часто употребляемую в работе терминологию. Тепловое равновесие в системе спинов. В макроскопическом ансамбле, протонов 12, помещнных в постоянное магнитное поле, разрешены две ориентации ядерного спина гг 12. Эти ориентации не равноценны по энергии. Состоянию с меньшей энергией соответствует значение гщ 12. В данном состоянии ядерный момент параллелен магнитному полю Н0. В состоянии с большей энергией направление поля и проекция ядерного спина антипараллельны. ЫаНрехруШокТ 1. Г абсолютная температура. Можно показать, что избыток заселенности нижнего уровня очень мал. Для протонов в поле Кэ он составляет лишь Однако с ростом напряженности постоянного магнитного поля он возрастает согласно 1. Именно избыток заселенности определяет чувствительность метода. Переходы между двумя энергетическими уровнями могут быть вызваны воздействием на систему переменного электромагнитного поля. Поглощение энергии происходит при условии, что магнитный вектор осциллирующего поля перпендикулярен направлению постоянного магнитного поля Н0 и частота со переменного поля удовлетворяет условию резонанса, т. Н0 2. Осциллирующее поле с равной вероятностью вызывает переходы спина из состояния а в Р и из р в а снизу вверх и обратно. Эти переходы прямо пропорциональны заселенностям, поэтому поглощение будет происходить только при условии, что заселенность состояния а больше, чем состояния р. Показано так же, что при наложении радиочастотного поля, первоначально существующая разность заселенностей экспоненциально уменьшается и, в конце концов, уровни становятся одинаково заселенными. Такое состояние называется насыщением. Уже сам факт существования теплового равновесия в системе спинов при наложении постоянного магнитного поля Но неизбежно требует, чтобы между ядрами и их окружением существовало взаимодействие, вызывающее переориентацию спина, связанную с передачей избыточной магнитной энергии другим степеням свободы. Это взаимодействие происходит благодаря броуновским межмолекулярным и внутримолекулярным движениям в образце. В этом случае соседние ядра, обладающие магнитным моментом, будут наводить на каждом отдельно взятом ядре флуктуирующие хаотические магнитные поля, содержащие компоненты с частотой, равной частоте резонанса СОо, которые будут вызывать переходы между уровнями спиновых состояний ядер. Такие безизлу нательные переходы между двумя состояниями аир, называют спинрешточной или продольной релаксацией.