Молекулярный и генетический анализ некоторых семейств гликозил-гидролаз микроорганизмов

• Автор: Наумов, Даниил Геннадиевич
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 163 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава I. Гликозилгидролазы принципы классификации

1. Классификации, основанные на энзиматических свойствах гликозидаз

2. Классификация, основанная на структурном сходстве гликозидаз

Глава II. Системы утилизации сахарозы грамположительных бактерий

1. Система утилизации сахарозы i ii 8

1.1. Два пути утилизации сахарозы

1.2. Сахаразный и левансахаразный регулоны сходство с опероном ii i

1.3. Леваназный оперон

1.4. Утилизация сахарозы у других штаммов i ii
2. Системы утилизации сахарозы у других представителей рода i
2Л. i i
2.2. i i
2.3. ii i x
2.4. i iii
2.5. i ii
2.6. i
2.7. Другие виды i
2.8. Штаммы i неизвестной видовой принадлежности
3. Системы утилизации сахарозы у других немолочнокислых грамположительных бактерий
3.1. 3
3.2. ii
3.3. iii
3.4. Актиномицеты
4. Системы утилизации сахарозы молочнокислых бактерий
4.1.
4.2. Другие представители рода 3
4.3. Ii 3
4.4. i
4.5. i и i
Глава III. Гены ферментации мелибиозы vii и других
видов дрожжей
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Бактериальные штаммы, среды и тестирование сбраживания сахарозы
2. Выделение ДНК из молочнокислых бактерий
3. Полимеразная цепная реакция
4. Методы генной инженерии
5. Среды для дрожжей и тестирование сбраживания мелибиозы
6. Штаммы дрожжей и методы генетической гибридизации
7. Молекулярное кариотипирование и Саузернгибридизация хромосом дрожжей
8. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Скрининг коллекции штаммов с помощью ПЦР
2. Секвенирование фрагмента гена i
3. Рестрикционное картирование локуса утилизации сахарозы
4. Сравнительный анализ последовательностей бактериальных сахараз
5. Генетическое картирование агалактозидазных генов семейства 1 в теломерах дрожжей vii
6. Идентификация нового семейства агалактозидазных генов
у vii
7. Генетическое картирование агалактозидазных генов семейства в теломерах дрожжей vii
8. Анализ аминокислотных последовательностей фруктозидаз.
Обнаружение фруктозидазного супсрсемейства
9. Арабиназы и ксилозидазы гомологи фруктозидаз 0 . Обсуждение результатов анализа структур белков фуранозидазного
суперсемейства
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Семейства гликозидаз с большим числом известных представителей было предложено подразделять на подсемейства ii, на основании уровня сходства аминокислотных последовательностей , 7, 3, 6. Многие ферменты с одинаковыми энзиматическими активностями не проявляют существенного сходства аминокислотных последовательностей, что обуславливает их попадание в разные семейства гликозилгидролаз . Например, фруктозидазы сахаразы, К. Ф. 3. и , агалакгозидазы мелибиазы, К. Ф. 3. 4, и , эндо1,4рксиланазы К. Ф. 3. 5, , и , арабинофуранозидазы К. Ф. 3. , , , и , а ксилан1,4рксилозидазы К. Ф. 3. 3, , , и . Рекорд в этом отношении принадлежит ферментам с эндо1,4рглюканазной активностью целлулазы, К. Ф. 3. ОН5, вН6, ОН7, Н8, Н9, ОН, вН, вН, СН, ОН, вН и ОН. Наряду с наличием ферментов с одинаковыми энзиматическими активностями в разных семействах гликозидаз, наблюдается и обратный феномен в состав около половины из известных семейств входят белки с различными активностями . Примером может служить аамилазное семейство вНЗ, объединяющее типов ферментов, среди них наряду с разнообразными гликозилгидролазами представлен ряд трансгликозидаз и даже трегалозосинтаза К. Ф. 5. К семейству ОН относятся ферменты с пятью типами гликозилгидролазных активностей К. Ф. 3. К.Ф. Семейство СН объединяет разнообразные ферменты с рОфруктофуранозилгидролазными и трансферазными активностями инулиназы К. Ф. 3. К.Ф. К.Ф. К.Ф. К.Ф. К.Ф. К.Ф. К.Ф. Картина становится ещ более сложной, если принять во внимание тот факт, что многие ферменты имеют широкую субстратную специфичность или проявляют несколько энзиматических активностей. Например, некоторые сахаразы высших растений наряду с сахарозой могут гидролизовать лактозу, раффинозу, стахиозу и трегалозу, однако, эффективность их гидролиза существенно ниже 8. Несмотря на большое разнообразие энзиматических активностей, проявляемых ферментами одного семейства гликозилгидролаз, удатся проследить некоторые закономерности. Например, гликозидазы семейства СН, как правило, могут использовать в качестве субстрата сахарозу, а основная часть гликозидаз семейства СН вовлечена в синтез или утилизацию крахмала. Консервативной в пределах каждого семейства гликозидаз также является аномерная конфигурация расщепляемой гликозидной связи а или Р, точнее говоря, е аксиальная или экваториальная ориентация 6, 0. Более высокая консервативность третичных структур белков в сравнении с первичными позволяет предполагать возможное сходство пространственных структур некоторых гликозидаз, относящихся к разным семействам. К настоящему времени известен целый ряд подобных случаев. Они, прежде всего, касаются семейств, содержащих белки с экспериментально определнными третичными структурами. В ряде других случаев о предполагаемом сходстве трхмерных структур гликозидаз можно судить на основании наличия отдалнного, но статистически достоверного сходства аминокислотных последовательностей этих белков. Семейства, к которым относятся гликозидазы, имеющие или предположительно имеющие родственные третичные структуры, было предложено объединять в суперсемейства 7. Число таких суперсемейств уже превысило десяток Табл. I и продолжает расти, что обусловлено тремя причинами. Вопервых, постоянно увеличивается число гликозидаз с известными пространственными структурами. Вовторых, в базах данных появляются новые последовательности, обладающие статистически достоверным сходством с представителями разных семейств тут действует правило друзья моих друзей мои друзья 7. Втретьих, вследствие повышения чувствительности методов анализа выявляются сходства между последовательностями гликозидаз разных семейств. Существующая классификация гликозилгидролаз , , 3, 4, 6, основанная на гомологии последовательностей, принимает во внимание сходство между белками только тех семейств, которые характеризуются одинаковым механизмом гидролиза гликозидной связи. Такие семейства объединены в кланы, которых к настоящему времени известно одиннадцать вНАСНК, Табл. I.