Молекулярная идентификация генетических мишеней

• Автор: Кузнецов, Борис Борисович
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 139 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Молекулярное маркирование прокариот

1.1. Применение гена, кодирующего рРНК, в качестве молекулярного маркера

1.2. Применение функциональных генов в качестве молекулярных маркеров

1.3. Методы сравнения полных геномов ДНКфингернринтинг

Глава 2. Молекулярная идентификация генетически модифицированных растений

2.1. Правовое регулирование в области биотехнологии генетическимодифицированных организмов.

2.1.1. Обзор законодательства ЕС, касающегося ГМО

2.1.2. Обзор законодательства Российской Федерации, касающегося ГМО

2.2. Выбор мишени для идентификации ГМО
2.3. Методы количественного определения содержания конкретной мишени в ДНК исследуемых образцов.
2.3.1. Конкурентная ПЦР
2.3.2. ПЦР в присутствии интеркалирующего флуоресцентного красителя
2.3.3. ПЦР с использованием гнбридизационных зондов молекулярных беконов
2.3.4. П1 с использованием дуплексных гибридизационных зондов.
2.3.5. ПЦР с использованием внутренних гидролизуемых зондов.
2.3.6. ПЦР с использованием гибридизационных зондов i.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Материалы и методы
3.1. Объекты исследования
3.2. Выделение ДНК.
3.2.1. Получение препаратов ДНК из биомассы микроорганизмов и растений.
3.2.2. Получение препаратов ДИК из пищевых продуктов.
3.3. ПЦР.
3.3.1. Амплификация фрагментов генов, колирующих рРНК
3.3.2. Амплификация фрагментов генов i
3.3.3. Амплификация фрагментов генов красного типа
3.3.4. IПЦР.
3.3.5. ПЦР
3.3.6. Амплификация фрагмента терминатора гена, кодирующего нопалинсинтетазу петуньи
3.3.7. Амплификация фрагментов генов, кодирующих рРНК
3.3.8. Амплификация целевых фрагментов геномной ДНК вируса мозаики цветной капусты
3.3.9. Амплификация целевых фрагментов геномной ДНК трансгенных растений сои.
3.4. Детектирование продуктов ПЦР
3.5. Очистка ПЦРфрагментов
3.6. Клонирование ПЦРфрагментов.
3.7. Выделение плазмндной ДНК
3.8. Секвенирование ДНК
3.9. Филогенетический анализ исследуемых последовательностей.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ ПРОКАРИОТ
Глава 4. Использование целевых генов прокариот в качестве молекулярных маркеров
4.1. Использование генов, кодирующих рРНК, в качестве молекулярных маркеров
4.1.1. Использование генов, кодирующих рРНК бактерий, в качестве молекулярных
маркеров.
4.1.2. Разработка системы праймеров для амплификации и секвснирования фрагментов генов рРНК у широкого круга архен
4.2. Комплексная молекулярная идентификация эубактсрий при помощи маркеров рДНК и функциональных генов
4.2.1. Применение универсальной системы праймеров для амплификации фрагментов
генов рРНК для молекулярной идентификации бактерий рода ii.
4.2.2. Применение универсальной системы праймеров для амплификации фрагментов генов i на примере бактерий рода ii.
4.2.3. Применение универсальной системы праймеров для амплификации фрагментов генов на примере бактерий рода ii.
Глава 5. Разработка и использование IПЦР в качестве метода интегрального сравнения геномов прокариот для создали я молекулярных маркеров различного уровня специфичности. .
5.1. Разработка метода IПЦР.
5.2. Разрабо тка молекулярного маркера, специфичного для группы галлообразующих бактерий i i
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МИШЕНЕЙ ЭУКАРИОТ
Глава 6. Разработка качественных и количественных методов идентификации трансгенных растений
6.1. Качественная идентификация ГМИ при помощи молекулярных маркеров, специфичных для вируса мозаики цветной капусты
6.2. Количественное определение конкретных трансформационных событий в продуктах питания
6.2.1. Выбор амшшкона на примере нуклеотидной последовательности
трансформационного события
6.2.2. Проверка применимости разработанной праймерной системы для проведения Г1ЦР РВ с использованием интеркалирующего красителя
6.2.3. Разработка ПЦР тестсистем для количественного определения трансформационных событий в продуктах питания
Глава 7. Разработка методов выделения ДНК
7.1. Разработка экспрессметода выделения ДНК из различных пищевых продуктов
ВЫВОДЫИЗ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Кроме того, анализ последовательностей Б рДНК является основным инструментом молекулярной экологии, что способствовало значительному расширению представлений о разнообразии прокариот в различных природных экосистемах. В отличие от традиционных микробиологических подходов, этот метод не требует выделения отдельных членов природного сообщества в чистые культуры, а основан на оценке разнообразия генов 8рРНК филотипов, представленных в суммарной ДНК изучаемого сообщества. Основным способом такой оценки является амплификация генов Б рРНК с последующим клонированием, секвснированием и филогенетическим анализом каждого гена. Анализ последовательностей 8 рДНК был использован для изучения биоразнообразия микроорганизмов различных морских, пресноводных, почвенных, термальных и гиперсоленых природных мест обитания, что привело к описанию различных новых филогенетических групп как бактерий, так и архей. Саргасова моря ivi . В различных экосистемах были найдены многочисленные новые нскультивируемые формы архей, принадлежащие к двум основным филогенетическим подразделениям и . Vii . Vii . Кроме того, молекулярноэкологические исследования горячих источников в Йсллоустонском национальном парке привели к предположению, что некоторые вновь открытые формы нскультивирусмых архей могуг быть представителями нового филогенетического подразделения, названного . Все это свидетельствует о том, что применение рДНК в качестве молекулярного маркера является чрезвычайно перспективным направлением молекулярной экологии прокариот и может быть использовано при поиске новых форм искультивируемых бактерий и архей в различных природных местообитаниях. Исследования природных сообществ выявили большое количество последовательностей, которые нельзя было идентифицировать на основе существующих баз данных. При использовании генов, кодирующих рРНК, в качестве молекулярных маркеров считается, что каждый отдельный штамм культивируемый организм и каждый член сообщества некультивируемый организм представлен уникальным типом последовательности рДНК филотипом. Такой принцип, безусловно, реализуется, если ген рДНК существует в геноме каждого организма в единственной копии. Для большинства прокариот это действительно так . Однако данный ген может быть представлен у прокариот и в нескольких копиях. У большинства организмов, содержащих в геноме множественные копии рибосомных генов, их количество составляет от 3 до 8. Организмы с большим количеством копий встречаются значительно реже, например, у ii i и найдено i . Максимальное в настоящее время количество копий генов рДНК, достигающее , обнаружено у ii x i . Различия между копиями на уровне первичной структуры нуклеотидных последовательностей генов рДНК имеет большое значение для филогенетического анализа, поскольку гетерогенность нуклеотидных последовательностей широко используемого молекулярного маркера гена рДНК, может повлиять на степень его достоверности. Описанные в литературе случаи достоверных различий между отдельными копиями данных генов можно условно разделить на две группы 1 микрогетерогенность, при минимальном уровне различий не более 2 и 2 макрогетерогенность, когда уровень различий довольно высок более 2. Большинство видов прокариот, принадлежащих к различным филогенетическим подразделениям, относится именно к первой группе. Копии гена рДНК оказались идентичными у различных штаммов стрептококков i . Незначительные различия были найдены между несколькими копиями генов рДНК у различных штаммов и природных изолятов рода Vii . Даже микрогетерогснность копий рДНК может приводить к невозможности применения метода прямого секвенирования ПЦРамнлификатов. Это произошло, в частности, при ссквенировании данного гена у одного из штаммов i , две копии которого различались всего лишь вставкой единственного нуклеотида на одной из позиций и заменами оснований еще на нескольких позициях i . Кроме того, обнаружение микрогетерогениости множественных копий 8рДНК в геномах различных штаммов стрептомицстов было прямо основано на неоднозначности результатов сиквеиса, когда в процессе электрофореза на одной позиции обнаруживалось более одного нуклеотида .