Идентификация и анализ активностей регуляторных элементов хромосомы 19 человека

• Автор: Руда, Вера Михайловна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1 Краткая история изучения ретровирусов и ретроэлементов

2.2 Жизненный цикл ретровирусов, их строение и синтез

2.3 Рстроэлементы происхождение, структура и классификация

2.4 Семейство V2

2.5 Функциональные элементы в составе

2.6 Биологическое значение

2.7 Инсулятор блокирование взаимодействия энхансера с промотором

2.8 Инсулятор защита от эффекта положения
2.9 Структурные особенности отдельных инсуляторов
2. Функции отдельных инсуляторов
2. Преодоление активности инсулятора
2. Механизмы действия инсуляторов
2. Перспективы использования инсуляторов
2. Заключение
3. Материалы и методы
3.1 Материалы
3.2 Методы
3.2.1 ПЦР амплификация
3.2.2 Трансформация .i и выделение плазмид
3.2.3 Рестрикция и лигирование
3.2.4 Культивирование клеток
3.2.5 Трансфекция клеток
3.2.6 Позитивнонегативная селекция
3.2.7 Получение клеточного лизата
3.2.8 Определение количества белка
3.2.9 Определение активности галактозидазы
3.2. Определение активности люциферазы
3.2. Выделение геномной ДНК

3.2. Картирование фрагментов в геноме человека
4. Результаты и обсуждение
4.1 ЬТЯ Обоснование выбора объекта
4.2 Описание опытных конструкций и экспериментального подхода
4.3 Промоторная активность ЬТЯ
4.4 Негативный регуляторный элемент НРЭ
4.5 Энхансерная активность ЬТЯ
4.6 Ткансспсцифичность энхансера БУ
4.7 Инсуляторная активность 8МАЯ
4.8 Система для поиска инсуляторов
4.9 Идентификация и картирование инсуляторов Выводы
Список литературы


v . Изменяя транскрипционный статус таких генов, интегрированный в геном может косвенно влиять на уровень экспрессии целого комплекса генов, что может приводить к серьезному изменению спектра экспрессирующихся в организме генов. Выступая индукторами таких изменений, могут играть важную роль в процессах развития различных патологий, таких как злокачественная трансформация клеток или аутоиммунные заболевания. Придавая геному хозяина дополнительную изменчивость, могут служить эволюционному развитию видахозяина, выступая в этом случае факторами эволюции. В настоящее время изучению биологической активности как эндогенных ретровирусов в целом, так и одиночных , посвящено немало работ, однако мы все еще далеки от полного понимания всех функций IIV в геноме. и влияния негативного регуляторного элемента НРЭ в его составе на активность . Целью второй части исследования является выявление участков геномной ДНК человека, обладающих инсуляторной активностью и анализ способности участков генома человека, специфически связывающихся с ядерным матриксом ix i i, служить инсуляторами или пограничными элементами, разделяющими функциональные домены генома. элементы одна из недавно открытых и относительно мало изученных групп регуляторных элементов. Они были найдены в геномах дрожжей, дрозофилы, позвоночных и растений. представляют собой участки ДНК 0 п. ЯМ. Они обладают повышенным сродством к ЯМ i vi и, как полагают, за счет связывания с ним образуют основания петельных доменов хроматина в ядре. Основной функцией, приписываемой , является образование, поддержание и регуляция функционирования петельных доменов интерфазного хроматина Глазков, Чернов и др. Ранее в нашей лаборатории были выделены, картированы и частично охарактеризованы несколько десятков элемситов из геномов человека и китайского хомячка. Эти последовательности различались подлине, коэффициентам связывания с ЯМ и некоторым другим характеристикам iv . Акопов и др. Николаев и др. v . Нашей задачей стало исследование их функциональной активности. Пять элементов, различающихся по длине и коэффициентам связывания с ЯМ, были проверены на наличие промоторной, энхансерной, сайленсерной и инсуляторной активностей. Инсуляторы это последовательности ДНК, способные, находясь между промотором и энхансером, блокировать активирующее действие последнего i viv, а также, будучи помещенными по краям генетической конструкции трансгена, вводимой генноинженерными способами в клетки, защищать экспрессию трансгена от эффекта положения , . Различными авторами были получены данные, указывающие на наличие у некоторых элементов свойств, характерных для инсуляторных последовательностей. В ароВ, и из локуса а1антитрипсина человека способны ограждать различные трансгены от эффекта положения i, i . элемента ii . В то же время, для ряда пограничных элементов, обладающих свойствами как , так и инсуляторов, было показано, что за выполнение этих функций отвечают разные, нспсрекрывающиеся последовательности в составе этих элементов , я. Возможно, при более детальном изучении взаимосвязей между инсуляторами и элсмснтами, удастся в каждом из них выделить отдельные последовательности, ответственные за свойства инсуляторов и связывание ЯМ. Цели и задачи работы. Настоящая работа посвящена идентификации и анализу активностей регуляторных элементов хромосомы человека и состоит из двух частей первая посвящена изучению тканеспсцифичности промоторной, энхансерной и сайленсерной активностей , принадлежащего семейству V2, а вторая выявлению участков ДНК хромосомы человека, обладающих инсуляторной активностью. Для решения второй задачи неотъемлемым этапом было создание метода, позволяющего проводить поиск инсуляторов в протяженных участках ДНК. X5 и Сох7А1.