Избирательная элиминация клеточных популяций конъюгатами на основе трансферрина человека и растительных токсинов

• Автор: Демина, Ирина Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 115 с.

Содержание.

Список сокращений .

Введение

Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Растительные токсины

1.1.1 Строение и свойства рицина

1.1.2 Токсины Vi

1.1.3 Взаимодействие растительных токсинов с клеточной поверхностью и их

и нтернализация.

1.1.4 Внутриклеточный путь растительных токсинов.

1.2 5 лимфоцитарный антиген как вектор для синтеза иммунотоксинов

1.2.1 5 лимфоцитарный антиген
1 .2.25 антитела и иммунотоксины на их основе.
1.3 Грансферрин и иммунотоксины на его основе.
1.3.1 Трансферрин
1.3.2 Трансферриновый рецептор.
1.3.3 Особенности внутриклеточного .транспорта трансферрина
1.3.4 Иммунотоксины на основе трансферрина и антител к ТфР.
1.4 Глиомы.
1.5 Неспсцифическая токсичность иммунотоксинов.
1.6 Моненсин и другие агенты, усиливающие цитотоксичносгь ИТ.
Заключение.
2.1 Выделение рицина и его субъединиц из ii i
2.2 Выделение токсинов и их субъединиц из растения Vi
2.3 Иммобилизация антител 8 на V
2.4 Получение гибридом, продуцирующих антитела против рицина.
2.5 Получение и очистка антител
2.6 Биотинилирование белков
2.7 Выделение мРНК.
2.8 Обратная транскрипция
2.9 Полимеразная ценная реакция
2. Иммунофлюоресценция .
2. Получение и очистка иммуннотоксинов.
2. Изучение взаимодействия антител с антигеном на плате с помощью иммуноферментного анализа
2. СэндвичТИФА на основе полученных монАт против рицина
2. Изучение диссоциации субъединиц токсинов под действием дитиогреитола с помощью иммуноферментного анализа.
2. Определение концентраций иммунотоксинов с помощью иммуноферментного анализа.
2. Мсчение Тф и иммунотоксинов флюорссцеинизотиоцианатом I.
2. Оценка цитотоксической активности токсинов и иммунотоксинов i vi.
2. Оценка цитотоксической активности иммунотоксинов x viv.
2. Изучение острой токсичности при однократном введении 5
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Гибридомы, продуцирующие антитела к Асубъединице рицина
3.2 Цитотоксическое действие конъюгатов на основе трансферрина
3.2.1 Выявление ТфР на поверхности клеток.
3.2.2 Получение иммунотоксинов на основе Тф.
3.2.3 Цитотоксическая активность конъюгатов с Тф i vi.
3.2.4 Цитотоксическая активность конъюгатов на основе Тф x viv
3.2.5 Влияние потеициирующих агентов на цитотоксическую активность ИТ. .
3.3 Активность иммунотоксинов на основе 5 антител.
3.3.1 Получение иммунотоксинов на основе 5 антител
3.3.2 Определение специфичности связывания i5.
3.3.3 Изучение острой токсичности при однократном введении 5.
Заключение
Список литературы


Рицин и вискумин относятся к группе рибосоминактивируюших белков II типа, в к которую входят также модецин, абрин, волкенсин, дифтерийный токсин, псевдомонадный экзотоксин А и др. ii , . Вес токсины этого семейства являются гликопротеинами, имеют сходную структуру и механизм действия. Как правило, они состоят из двух субъединиц, связанных дисульфид Асубъединица является высокоспецифической гликозидазой, Всубъединица лектин, специфичный к остаткам галактозы. Строение н свойства рицина. Наиболее изученным токсином среди РИБ II типа является рицин. Он находится в вакуолях зрелых семян ii i вместе с другими секреторными белками. Биологическая роль рицина пока не выяснена. Существуют предположения, что он может играть криопротекгивную роль, а также быть защитой от бактериальных и грибковых инфекций ii . i . Известно, что он полностью разрушается после раскрытия семян. Рицин, как и все другие представители РИБ II, типа является гетеродимериым белком, состоящим из iv и ВЫпбтсубъединиц, соединенных одной дисульфидной связью. Рицин был первым белком ЭТОГО семейства, для которого была построена пространственная модель с помощью рентгеноструктурного анализа , . I , , i КС , . Ацепь состоит из 7 аминокислот, имеет 2 сайта гликозилирования и один активный центр, охарактеризованный с помощью мутагенеза , . Вцепь состоит из 2 аминокислот, имеет 3 функциональных сайта связывания галактозы и также содержит 2 сайта гликозилирования V , . Дисульфидная связь образуется между 9м в и 4м в остатками цистеина. Она оказывается экспонированной на поверхности молекулы рицина , . Кроме дисульфидной связи, в объединении субъединиц рицина участвуют гидрофобные и полярные взаимодействия i , . ингибирует синтез белка в клетке за счет повреждения рибосом и способна инактивировать приблизительно рибосом в минуту. Таким образом, проявления токсичности служат очень чувствительной тестсистемой для отслеживания попадания цепи в цитозоль АН , . Она расщепляет гликозидазную связь аденина в положении рРНК субъединицы рибосом , . Этот выщепляемый остаток аденина находится в петле и стеблевой последовательности рибосомальной РНК, имеющей специфический тетрануклеотид . Следовательно, распознает именно эту структуру А , . После остановки синтеза белка клетка погибает, впадая в апоптоз, характеризующийся конденсацией хроматина, фрагментацией ядра и выпячиванием клеточной поверхности i , . Токсины Vi . Растительный токсин вискумин МЫ был выделен из листьев Vi омелы белой. Кроме него в экстрактах из листьев омелы содержатся родственные белки II и 1II Н, . Большой интерес к этим экстрактам обусловлен применением их в терапии различных онкологических заболеваний. В основном в них содержится I, но соотношение всех трех лектинов довольно значительно меняется в зависимости от времени года, места произрастания и даже деревахозяина. Как и рицин, все три токсина состоят из двух субъединиц, соединенных дисульфидной связью. Асубъсдиница так же выщенляет остаток аденина в рРНК эукариот , . Всубъединица обладает высокой аффинностью к терминальной галактозе и низкой аффинностью к ацетилгалактозамину Н, , , . Рентгеноструктурный анализ показал значительное сходство третичной структуры вискумина и рицина ЕС 3. Дисульфидная связь в молекуле вискумина образуется между 7м в и 5м в остатками цистеина. Примерно молекулярного веса вискумина составляют углеводы глюкоза, галактоза, мапноза, ацстилгатактозамин, фукоза и ксилоза Н, . Рицин является чрезвычайно удобной моделью для изучения всех процессов внутриклеточного пути молекул, начиная от связывания с поверхностными рецепторами и кончая сложными внутренними событиями.